阳离子氨基酸转运蛋白-1 (CAT-1)在类风湿性关节炎中通过吸收l -精氨酸促进成纤维细胞样滑膜细胞增殖和细胞因子分泌

背景

滑膜衬层中纤维母细胞样滑膜细胞(FLSs)的异常增殖是类风湿性关节炎(RA)滑膜增生和关节破坏的主要原因。目前，代谢异常与FLS增殖之间的关系是一个新的研究热点。然而，氨基酸代谢与RA的关系尚不清楚。

方法

RA滑膜液中氨基酸和细胞因子的浓度(n= 9)和骨关节炎(OA，n= 9)分别用LC-MS /MS和CBA法检测。采用实时荧光定量PCR和蛋白印迹法检测RA和OA患者FLSs中阳离子氨基酸转运体-1 (CAT-1) mRNA和蛋白的表达。在常氧和低氧培养条件下，用siRNA敲除CAT-1或用d -精氨酸处理的FLSs中测定MTT测定、细胞周期、凋亡、侵袭和细胞因子分泌。采用小鼠胶原诱导关节炎(CIA)模型，检测阻断l -精氨酸摄取的体内治疗潜力。

结果

RA患者滑膜液中L-rginine上调，并与IL-1β、IL-6和IL-8细胞因子的升高呈正相关。进一步的检查表明CAT-1是l -精氨酸的主要转运体，在RA FLSs上过表达。此外，siRNA敲除CAT-1或用d -精氨酸抑制l -精氨酸摄取均可显著抑制RA FLSs在体外常氧和低氧培养条件下的l -精氨酸代谢、细胞增殖、迁移和细胞因子分泌，但增加细胞凋亡，且呈剂量依赖性。同时，体内试验显示，无l -精氨酸饮食或使用d -精氨酸阻断l -精氨酸摄取抑制CIA小鼠关节炎进展。

结论

CAT-1上调，通过吸收l -精氨酸促进FLS增殖，从而促进RA进展。

• RA患者滑液中L-rginine上调，主要通过CAT-1转运。

• 使用siRNA敲除CAT-1或使用d -精氨酸抑制l -精氨酸摄取显著抑制了RA FLSs中的l -精氨酸代谢、细胞增殖、迁移和细胞因子分泌。

类风湿关节炎(RA)是一种以慢性、对称性和多关节炎症为特征的最常见的全身自身免疫性疾病，影响着全球近0.5% - 1%的人口，中国发病率为0.32% - 0.38%。高致畸率是造成人口丧失劳动力和残疾的主要原因[1］．尽管类风湿关节炎的治疗方法在不断改进，但仍然没有治愈类风湿关节炎的方法，只有缓解症状。RA的典型病理特征为滑膜组织异常增生，腐蚀周围的肌腱、韧带、软骨和骨骼，导致关节进行性损伤和畸形，最终出现不同程度的功能障碍[2］．滑膜衬层中纤维母细胞样滑膜细胞(FLSs)的异常增殖是滑膜增生和关节破坏的主要原因[3.]，因此抑制FLSs在RA中的过度增殖是RA潜在的治疗靶点。

细胞微环境中的许多因素可以激活细胞代谢的关键信号通路，促进细胞生长和存活[4，5］．目前代谢异常与FLS增殖之间的关系是一个新的研究热点[6］．例如，抑制糖酵解可缓解fls介导的滑膜炎[7]，阻断胆碱激酶α可通过抑制FLS功能缓解滑膜炎[8］．然而，氨基酸代谢与RA的关系尚不清楚。

l -精氨酸(L-Arg)是健康人体内一种非必需氨基酸。它主要来源于蛋白质降解和饮食摄入，并参与体内的能量代谢和蛋白质合成。肿瘤学领域的研究已经证实，一些肿瘤细胞的生长明显依赖外源性精氨酸，包括肾癌、肝癌、胰腺癌和前列腺癌[9，10］．近年来，应用精氨酸脱亚胺酶(ADI)从肿瘤组织和血液中去除精氨酸抑制肿瘤生长进入临床研究[11，12，13］．然而，多项临床研究表明，ADIs对肿瘤的治疗并没有明显的疗效。进一步的研究发现，这些治疗失败是因为体内去除精氨酸后，机体自身免疫功能的抗肿瘤活性受到抑制。

RA是一种免疫系统的超功能性，淋巴细胞激活和细胞因子分泌是引起免疫损伤的主要因素。RA FLSs是关节滑膜增生的主要固有细胞成分，已被证明具有“肿瘤样”生长特征:异常增生[3.］．为此，我们研究了RA FLS摄入精氨酸的分子机制，并试图寻找新的靶向分子，专门限制FLS摄入精氨酸，以抑制FLS的异常增殖，降低RA的免疫活性。

细胞摄取l -精氨酸主要通过阳离子氨基酸转运体(CATs)进行[14]，其成员包括SLC7A1 (CAT-1)、SLC7A2 (CAT-2)、SLC7A3 (CAT-3)、SLC7A4 (CAT-4)和SLC7A14。其中CAT-1在除成人肝脏和泪腺外的所有组织中都有不同程度的表达[15］．然而，迄今为止，关于CATs在RA中的表达模式尚未见报道。

在本研究中，我们研究了l -精氨酸在RA发病机制中的作用，并评估了FLSs吸收l -精氨酸的转运蛋白。我们研究了l -精氨酸对体外FLS生长和体内胶原诱导关节炎(CIA)小鼠FLS生长的影响，证实CAT-1在l -精氨酸介导的FLS增殖和细胞因子分泌中发挥重要作用，促进RA的进展。

患者样本和伦理批准

滑膜组织和滑膜液取自RA (n= 9)和骨关节炎(n= 9例在同济大学上海东方医院接受关节镜手术的患者。所有患者均符合美国风湿病学会(ACR)对RA和OA的诊断标准。所有患者均未接受术前治疗。每位患者都提供了知情同意。本研究由上海东方医院伦理委员会(编号:2020tjdx)批准，并按照《赫尔辛基宣言》的指导方针进行。

主细胞培养

关节镜手术中获得的关节内滑膜组织立即切成1mm^3.无菌条件下的产品。组织碎片被放置在25cm²培养瓶中加入少量RPMI 1640完全培养基(含10%胎牛血清，1%青霉素和链霉素)。培养瓶被倒置在5%的CO中₂37°C培养4-6 h。当成纤维细胞从组织块中产生后，加入适量完全培养基进行培养。当原代细胞生长到融合率约80%时，进行传代。本研究中使用的细胞经过3至8代的培养。FLSs在常氧条件下培养(21% O₂, 5%的公司₂)和/或缺氧情况(3% O₂, 5%的公司₂)在BioSpherix氧控制系统中的37°C。RPMI 1640和FBS采购自ThermoFisher Scientific, MA, USA。

LC-MS /MS法检测氨基酸

采用LC-MS /MS法测定RA和OA滑膜液中氨基酸浓度和RA FLSs培养上清中l -精氨酸浓度。简单地说，转染CAT-1-siRNA (GenePharma, Shanghai, China)的RA FLSs以5 × 10的比例被转染⁶细胞/孔置于6孔板中，在常氧或低氧条件下培养24小时。收集上清液，以5 μl注入Agilent HILIC Plus rhd柱(Agilent, CA, USA)。流速恒定在400 μl/min，检测氨基酸。

仪珠阵列

使用细胞仪珠阵列(CBA)(BD Bioscience, NJ, USA)检测细胞因子:静脉收集2 ml血液，分离血清。取血清50微升、6种细胞因子混合物50µl、PE荧光染料50µl充分混合，室温反应3 h后，每管加1 mL溶液，离心5 min (2000 r/min)，弃上清。然后再加入120µl的溶液，摇匀，3-5 min后检测。每批试剂盒制作标准曲线，根据试剂盒说明书配制标准品稀释剂，实验时设置标准管和阴性对照，使用美国BD公司的CBA软件进行分析。

RA fls中CAT-1敲除

为了在RA FLSs中敲除CAT-1的表达，我们使用了两个靶向敲除CAT-1的siRNA (si-CAT1-833: sense 5 ' - ggacacacaugacucugaat -3 '，反义5 ' -UUCAGAGUCAUGUGUGUCCTT-3 ';si-CAT1-1704:sense 5 ' - ccguucuguuugaacaautt -3 '，反义5 ' -AUUGUUCAAACAGAGACGGTT-3 ')和一个非沉默sirna (GenePharma, Shanghai, China)作为对照。根据制造商说明，使用Lipofectamine 2000试剂(ThermoFisher Scientific, MA, USA)将CAT1-siRNA或Ctrl-siRNA转染到RA FLSs中。转染48小时后，用RA FLSs测定其功能。

细胞周期与凋亡评估

对数生长期的RA FLSs以2 × 10的倍数进行镀接⁵将细胞/孔置于6孔板中，在常氧或低氧条件下培养24小时。加入不同浓度(2mm、4 mM、8 mM、16 mM和32 mM)的d -精氨酸(Sigma-Aldrich, MO, USA)，同时设置对照。培养48 h后，收集细胞，用PBS洗涤2次。每个样品用5 μL Annexin V和5 μL PI溶液(BD Bioscience, NJ, USA)在4℃下染色30 min。用BD Aria II流式细胞仪检测FLSs的凋亡率，并用Diva软件分析。

用上述方法收集细胞，取1 × 10⁵FLSs固定在1 mL 70%乙醇溶液中，4℃过夜。然后以1000转/分离心5分钟，取出固定液。用预冷PBS冲洗3次后，每管加入100 μL的100 μg/mL RNase (BD Bioscience, NJ, USA)。用RNase在37℃孵育30 min降解RNA，然后加入100 μL的50 μg/mL PI (BD Bioscience, NJ, USA)染色液，4℃孵育30 min。用BD FACSCalibur流式细胞仪检测细胞周期，用ModFit软件分析结果。

免疫印迹

100微克RA或OA患者的滑膜组织，以及转染siRNA或在缺氧条件下培养48小时的RA FLSs，加入100µL的RIPA细胞裂解液(Beyotime, Inc.， Shanghai, China)，以提取细胞总蛋白。使用BCA试剂盒(Beyotime, Inc.， Shanghai, China)测定总蛋白浓度。等量蛋白质样品在10%聚丙烯酰胺凝胶上分离，并转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。将膜在5%脱脂牛奶中阻塞1小时，同时在室温下摇晃，一抗(CAT-1, 1:1000, Sigma-Aldrich, MO, USA;1:1000 HIF-1α,细胞信号技术加入WWLP, USA)， 4℃孵育过夜。我们使用β-肌动蛋白(1:1000,Santa Cruz, TX, USA)作为加载控制。第二天，将含有辣根过氧化物酶标记的二抗加入膜中，孵育1 h。利用奥德赛红外成像系统检测CAT-1、HIF-1α和β-actin的蛋白表达水平。用ImageJ软件对相应蛋白的密度进行定量分析。

MTT试验

将对数生长期的RA FLSs以5 × 10的浓度镀至96孔板中^3.细胞/mL，每组重复孔3个。然后在每个孔中加入200 μ l的细胞悬液。96孔板在37℃下进行正常氧和3%缺氧培养，培养第1、2、3、4天进行MTT试验如下:每孔加入5 mg/mL MTT试剂(Promega, WI, USA)(20µl)，继续培养4 h。然后取上清液，每孔加入150µl DMSO (Sigma-Aldrich, MO, USA)，摇板15 min。然后用微板仪(波长570 nm)测量每孔的OD值。

RNA提取和实时PCR

使用TRIzol™试剂盒(ThermoFisher Scientific, MA, USA)提取RA和OA滑膜组织的总RNA，并根据第一链cDNA合成试剂盒(TaKaRa, Kyoto, Japan)的说明将其反转录为cDNA。采用SYBR预混Ex Taq II PCR (TaKaRa, Kyoto, Japan)对ABI Q6进行实时聚合酶链反应(Real-time PCR)。反应条件为95°C预变性30 s, 95°C变性5 s, 60°C退火30 s，共40个循环。溶出曲线分析，每个样品重复运行3次。反应体积为20µL，其中2µL cDNA, 0.8µL引物，10µL SYBR预混料，0.4µL ROX, 20µL中加入了超纯水。2^−ΔΔCt方法进行数据分析。引物序列见补充表1．

免疫组织化学分析

部分RA和OA滑膜组织标本固定于10%甲醛溶液(Beyotime, Inc.， Shanghai, China)中，石蜡包埋，切片厚度为4µm, 80°C烤箱烘焙，乙醇脱水，内源过氧化物酶灭活，高温高压柠檬酸缓冲液水化。PBS冲洗3次，4℃加入一抗(CAT-1, Sigma-Aldrich, MO, USA)过夜。随后，用PBS洗涤样品3次，加入二抗(兔抗小鼠IgG-HRP, Santa Cruz, TX, USA)。室温下，加入二氨基联苯胺(DAB) (Beyotime, Inc.， Shanghai, China)显色，苏木精对比染色，加入1%盐酸乙醇5min。然后用水冲洗5min，然后进行乙醇梯度脱水(80%、85%、90%、95%、100%、100%)和二甲苯透明处理，干燥，最后用胶封。阴性对照为PBS代替一抗。

细胞迁移试验

根据康宁®BioCoat™Matrigel®入侵检测试剂盒(康宁，NY, USA)， 1 × 10⁵转染siRNA或经d -精氨酸处理的细胞/孔RA FLSs被植入不含胎牛血清的培养基的上室，而下室则是含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基。在常氧或低氧条件下培养24 h后，去除上腔内非侵袭性FLSs，底表面侵袭性细胞用甲醇固定，结晶紫染色，随机选择5个视野进行计数。

胶原诱导的关节炎(CIA)

雌性DBA/1只小鼠(n= 18)， 8周龄，随机分为缺l -精氨酸喂养组、治疗组和对照组3组。l -精氨酸缺失喂养组小鼠在模型诱导前2周饲喂无精氨酸饲粮，治疗组和对照组小鼠饲喂正常饲粮。治疗组在注射牛型胶原蛋白7 d前给予含d -精氨酸的水2mg /ml。CIA诱导根据报道的方法进行[16]:牛II型胶原蛋白(Sigma-Aldrich, MO, USA)溶于0.1 mol/L醋酸至终浓度为2g /L，与完全弗氏佐剂(V:V = 1:1)混合乳化(Sigma-Aldrich, MO, USA)制备II型胶原蛋白乳剂。乳剂分别于第0天和第21天皮下注射于一、二次免疫小鼠尾部。

关节炎指数(AI)评价

从初级免疫第1天开始，每3天用AI评分记录多发性关节炎病变的发生率和严重程度。AI分为5个等级(从0到4分):0 =无红肿;1 =小脚趾关节红肿;2 =所有关节和脚趾红肿;3 =踝关节以下出现红肿;4 =所有部位都红肿，包括踝关节。如果至少有一只脚红肿，包括踝关节，则认为关节炎诱导成功。

统计分析

以上所有数据均以至少3个独立实验的平均值±SD表示。采用SPSS 17.0统计软件和GraphPad Prism 8软件对结果进行分析。两组定量资料采用双尾Student量表进行分析t-检验，三组或三组以上组间比较采用单因素方差分析。用Pearson相关法对氨基酸与细胞因子进行相关性分析。一个p-value小于0.05为有统计学意义。

RA滑膜液中l -精氨酸上调，与细胞因子升高呈正相关

采用LC-MS /MS法测定RA和OA滑膜液中18种氨基酸的浓度。n= 9)。结果显示，RA滑膜液中l -精氨酸、l -瓜氨酸、l -天冬酰胺、l -亮氨酸、l -赖氨酸、l -蛋氨酸、l -酪氨酸、l -装饰、l -异亮氨酸、l -丝氨酸、l -脯氨酸、l -苏氨酸、l -色氨酸和l -缬氨酸14种氨基酸的浓度显著高于OA(图)。1a).其他4种氨基酸(l -丙氨酸、l -谷氨酸、甘氨酸和l -组氨酸)的浓度在RA和OA滑膜液中无显著差异(补充图。1a).接下来，我们评估了细胞因子(IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、INF-γ、INF-α、TNF-α、IL-12P70)的浓度，发现与OA相比，RA滑膜液中IL-1β、IL-6和IL-8显著升高(图1)。1b).然而，其他细胞因子(IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, INF-γ， INF-α， TNF-α， IL-12P70)在RA和OA之间无显著差异(补充图。1b).此外，我们分析了RA患者滑液中氨基酸和细胞因子之间的关系，发现只有l -精氨酸与IL-1β、IL-6和IL-8水平升高呈正相关(图。1c)。

精氨酸转运蛋白CAT-1在RA FLSs中过表达，在缺氧条件下升高

由于FLSs的异常增殖是RA滑膜增生和关节破坏的主要原因，我们采用real-time PCR分析RA和OA滑膜组织样本中常见精氨酸转运体(SLC7家族)mRNA表达(n= 9)。在RA FLSs中存在的多种氨基酸转运蛋白中，SLC7A1(也称为阳离子氨基酸转运蛋白-1,CAT-1)和SLC7A2-2A已被证实与OA相比上调。然而，SLC7A14被下调。其他氨基酸转运蛋白无显著差异(图。2a).接下来，我们通过western blot检测从RA和OA滑膜组织分离和培养的FLSs中CAT-1和SLC7A2-2A的蛋白水平。结果显示，CAT-1在RA FLSs中的表达明显高于OA FLSs(图1)。2b, c).无法检测到SLC7A2-2A(数据未显示)。与western blot结果一致，RA滑膜组织中CAT-1蛋白表达高于OA滑膜组织，如图所示。2d。

此外，由于类风湿关节炎滑膜含氧量降低，且3%的氧被证实代表类风湿关节炎的关节环境，我们将类风湿关节炎FLSs培养在3% O下₂孵育24 h，测定CAT-1蛋白表达。结果显示，缺氧条件下CAT-1表达上调，缺氧诱导因子-α (HIF-α)表达升高(图2)。2e、f)。

CAT-1在RA中通过转运l -精氨酸促进FLS细胞生长，抑制细胞凋亡

为了确定CAT-1在RA FLSs中的生物学功能，我们对经CAT-1- sirna或Ctrl-siRNA处理并在常氧或低氧条件下培养的FLSs进行了细胞增殖、凋亡和细胞周期分析。Western blot分析显示，在常氧和低氧条件下，用siRNA敲除CAT-1后，RA FLSs中CAT-1蛋白表达显著降低(图1)。3.a, b).采用LC-MS /MS测定RA FLSs培养上清液中l -精氨酸的浓度，发现在常氧和低氧条件下，通过siRNA沉默CAT-1, RA FLSs培养上清液中l -精氨酸的浓度升高，说明CAT-1是RA FLSs中l -精氨酸的主要转运体(图1)。3.c, d)。

d -精氨酸是l -精氨酸的竞争性抑制剂。MTT法用于评估CAT-1敲除或d -精氨酸处理后的细胞生长。如图所示。4a，与转染Ctrl-siRNA的RA FLSs相比，转染CAT-1-siRNA或D-arginine处理的RA FLSs表现出显著的生长抑制。我们还使用流式细胞术分析了细胞周期进展，发现与转染Ctrl-siRNA的RA FLSs相比，转染CAT-1-siRNA或d -精氨酸处理的RA FLSs G0/G1期显著增加，S期显著减少(图1)。4b, c)。

流式细胞术检测CAT-1在正常和无精氨酸培养基中是否影响细胞凋亡。有趣的是，在正常培养基中，与ctrl - sirna处理的RA FLSs相比，cat -1- sirna处理的RA FLSs中早期凋亡细胞的百分比显著增加，而在常氧或低氧环境下的无精氨酸培养基中则没有。此外，与正常培养基相比，无精氨酸培养基中早期凋亡细胞的比例明显增加(图1)。5a, b)。此外，我们研究了不同浓度d -精氨酸对细胞凋亡的影响，正如预期的那样，随着d -精氨酸浓度的增加，凋亡细胞显著增加(图1)。5c, d)。这些结果表明，在RA FLSs中，CAT-1是细胞增殖所必需的，通过运输l -精氨酸实现细胞增殖。

CAT-1增强RA FLSs的迁移，促进细胞因子的分泌

为了确定CAT-1是否在RA FLS迁移中发挥作用，我们进行了Transwell试验，并证明了在等氧和低氧培养条件下，与Ctrl-siRNA处理相比，CAT-1敲除或d -精氨酸处理显著减少了细胞迁移(图1)。6a, b)。此外，评估IL-1β、IL-6和IL-8，以评估CAT-1对RA FLSs细胞因子分泌的影响。如图所示。6c，与ctrl - sirna处理的细胞相比，CAT-1的敲除或d -精氨酸处理降低了RA FLSs上清液中IL-1β、IL-6和IL-8的浓度。这些结果表明CAT-1在RA FLS的体外迁移和细胞因子分泌中起重要作用。

抑制l -精氨酸的摄取抑制CIA小鼠诱导

我们接下来评估了l -精氨酸在胶原诱导关节炎小鼠模型中的作用。将牛II型胶原蛋白注射到DBA/1小鼠尾静脉诱导关节炎，评价l -精氨酸剥夺和d -精氨酸添加对CIA的影响。如图所示。7a和b，我们发现，与对照组相比，l -精氨酸剥夺和d -精氨酸添加显著抑制了这些小鼠的关节炎诱导。CIA对照组的关节炎指数高于l -精氨酸剥夺组和d -精氨酸治疗组。进一步的组织病理学资料证实，伴有CIA症状的对照组伴关节内大量炎症细胞浸润和腹股沟淋巴结肿大(图。7c, d)。

研究发现l -精氨酸在人体免疫细胞功能中起着非常重要的调节作用[17，18，19］．最近有报道称，增加l -精氨酸的浓度可以改变T细胞从糖酵解到氧化磷酸化的代谢状态，提高T细胞的存活率，促进抗肿瘤免疫反应的产生，而l -精氨酸的剥夺使免疫功能减弱[20.］．l -精氨酸也被用于提高癌症患者的免疫力以治疗肿瘤[21］．去除l -精氨酸治疗癌症是一把双刃剑。在抑制肿瘤细胞生长的同时，也极大地抑制自身免疫细胞清除肿瘤细胞的能力。因此，去除精氨酸治疗癌症的策略还有待验证。风湿性关节炎是一种由免疫功能亢进引起的自身免疫性疾病。在致癌性关节腔内，不仅有“肿瘤样”特征的FLSs异常增殖，侵蚀关节，还有大量炎症信息浸润和炎症因子分泌引起的炎症反应。因此，限制l -精氨酸的吸收在RA患者中可能比作为一种肿瘤治疗更有前途，因为阻断l -精氨酸的吸收不仅可以抑制FLSs的增殖，还可以缓解免疫功能亢进。

令人惊讶的是，我们的结果证实RA中所有14种氨基酸的浓度高于OA，但只有l -精氨酸浓度升高与炎症细胞因子IL-1β、IL-6和IL-8水平升高呈正相关。这可能是因为RA中FLSs的异常增殖需要大量的营养物质，高浓度的l -精氨酸促进了FLSs的增殖和免疫细胞的激活:增加的FLSs分泌的细胞因子数量增加，而激活的免疫细胞也会分泌大量的细胞因子。此外，先前的研究表明，除了IL-1β、IL-6和IL-8外，其他细胞因子，如TNF-α和IFN-γ，在RA关节液中也升高[22，23，24，25]，但在本研究中，与在OA滑液中观察到的浓度相比，没有显著差异。这可能是由于样本量小(本研究只使用了9个样本)，也可能是应该选择不同的对照样本。而IL-1β、IL-6和IL-8是RA炎症反应中最常见的细胞因子，因此用它们来代表RA的炎症状态。

氨基酸不能自由通过细胞膜，必须通过特定的转运体从细胞外空间运输到细胞内空间。精氨酸转运蛋白主要是阳离子氨基酸转运蛋白，包括SLC7A1 (CAT-1)、SLC7A2 (CAT-2)、SLC7A3 (CAT-3)、SLC7A4 (CAT-4)和SLC7A14。其他蛋白质SLC7A5-SLC7A13是主要的l型氨基酸转运体[15］．为了确定哪一种转运蛋白RA FLSs主要转运精氨酸，我们检测了SLC7家族转运蛋白，发现RA FLSs中SLC7A1 (CAT-1)和SLC7A2-2A mRNA表达量增加，但CAT-1的表达量增加显著。进一步的WB和免疫组化结果证实了CAT-1蛋白在RA FLSs中的表达明显增加。因此，我们认为CAT-1是RA FLSs的主要精氨酸转运蛋白。

有研究证实，炎症性关节炎患者滑膜腔内氧含量低于正常人群，炎症关节滑膜腔内氧含量低与微血管增生、滑膜增生和氧化损伤有关[26，27，28］．本研究采用3% O2作为缺氧培养条件，模拟RA关节腔内微环境，这与其他研究结果一致[29］．缺氧促进RA FLSs增殖，抑制细胞凋亡。有研究者认为RA缺氧环境的原因是关节腔内细胞异常增殖消耗大量氧气，导致局部缺氧[30.］．缺氧促进血管生成，抑制细胞凋亡，进一步促进细胞增殖，形成正反馈循环，加重缺氧微环境。令我们惊讶的是，在常氧和低氧环境中，抑制RA FLS对l -精氨酸的摄取显著减少了FLS的增殖、侵袭和细胞因子的分泌。这些结果表明，l -精氨酸在RA FLSs中的作用与缺氧环境无关。

正常人类细胞通过一氧化氮合酶和鸟氨酸-多胺途径利用l -精氨酸进行代谢[31］．精氨酸经精氨酸酶(ARG)代谢生成鸟氨酸，鸟氨酸经ODC代谢生成多胺。腐胺在肿瘤发生和细胞增殖中发挥重要作用[32］．精氨酸也是一氧化氮合酶(NOS)的底物，其代谢产物为一氧化氮(NO)和瓜氨酸。研究发现，缺氧可引起细胞代谢的改变，诱导iNOS的产生。在iNOS的催化下，生成的NO可稳定缺氧诱导因子HIF的激活状态，促进细胞增殖[33］．HIF是一种调节细胞氧平衡和缺氧反应基因表达的核转录因子，在缺氧条件下表达增加，已被证实通过多种途径抑制细胞凋亡，促进细胞增殖和存活，如p53 [34，35，36］．此外，有报道称，在小鼠RA模型中，NO含量显著增加，促进类风湿关节炎滑膜增生和炎症损伤[37］．然而，目前还没有关于l -精氨酸促进RA FLSs细胞生长的代谢途径的报道，这也是我们下一步计划研究的内容。

CAT-1是一种膜蛋白，可能是单克隆抗体靶向治疗的理想靶点。虽然正常组织表达CAT-1的基础水平，但RA FLSs显著过表达CAT-1，说明抗CAT-1单克隆抗体在RA FLSs中很敏感，而对正常细胞影响不大。靶向CAT-1的单克隆抗体不仅可以抑制RA FLSs对l -精氨酸的吸收和抑制滑膜增生，还可能通过削弱T细胞免疫抑制疾病进展。

我们的实验表明CAT-1上调并通过吸收l -精氨酸促进FLS增殖，从而促进RA进展。抑制l -精氨酸的摄取可降低RA FLS的体外生长和细胞因子的分泌，并抑制体内关节炎的诱导。这些发现强调了CAT-1靶向RA FLSs的组成性合成代谢的临床和治疗价值。

本研究中使用和分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。

ACR:

美国风湿病学会

阿迪:

精氨酸deiminase

人工智能:

关节炎指数

cat 1:

阳离子氨基酸转运蛋白-1

CBA:

仪珠阵列

情报局:

胶原诱导的关节炎

读者:

呈synoviocytes

办公自动化:

骨关节炎

PVDF:

聚偏二氟乙烯

类风湿性关节炎:

类风湿性关节炎

我们要感谢于作人教授(同济大学医学院上海东方医院转化医学研究中心)的建议和帮助。

国家自然科学基金项目(No. 82001725、81972183)、江西省自然科学基金项目(No. 20181BAB205033)、上海市卫生健康委员会项目(No. 20181BAB205033)资助。YYXX202101)。

作者和联系

1. 200120上海浦东即墨路150号同济大学医学院上海东方医院检验科

   吕颖，于珊珊，丁梦蕾，范烈英

2. 上海东方医院吉安医院，江西省吉安市吉安南路80号，邮编343000

   应陆

3. 同济大学医学院上海东方医院转化医学研究中心，上海浦东即墨路150号，200120

   郝崇波，马祖安，傅雪莲，秦明清，徐增光

贡献

YL, LYF和ZGX设计并执行了研究，分析了数据，并撰写了手稿;CBH完成了大部分实验;SSY和MQQ制作小鼠模型;ZM和XLF行免疫组化;MLD分析了数据。所有的作者都阅读并认可了最终的手稿。

相应的作者

对应到应陆，Zengguang徐或Lieying风扇．

伦理批准和同意参与

本研究经同济大学附属上海东方医院伦理委员会(No. 2020tjdx)批准，并根据《赫尔辛基宣言》获得每位患者的书面知情同意。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争利益。

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