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脂肪来源间充质干细胞/间质细胞通过低分子肝素增强迁移能力和肝细胞生长因子分泌对博莱霉素诱导的系统性硬化症小鼠模型的治疗作用gydF4y2Ba

摘要gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

脂肪来源间充质干细胞(ASCs)作为一种治疗系统性硬化症(SSc)的新方法受到了关注。低分子肝素(LMWH)可以增强细胞功能,刺激多种细胞产生肝细胞生长因子(HGF)。本研究探讨了低分子肝素对小鼠ASCs (mASCs)功能的影响,以及低分子肝素激活的mASCs (hep-mASCs)在小鼠SSc模型中的治疗作用。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

测定不同浓度低分子肝素培养的mASCs的细胞功能。小鼠分为四组:BLM (BLM)诱导的SSc (BLM-单用BLM)、BLM- masc诱导的SSc (BLM- masc)、BLM- masc与10、100 μg/mL低分子肝素活化的masc (BLM-hep- masc)诱导的SSc;每组9只(gydF4y2BangydF4y2Ba= 9)。通过组织和生化检查及基因表达水平评估皮肤炎症和纤维化。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

体外实验表明,hep-mASCs的迁移能力和HGF生成明显高于单独的mASCs。细胞迁移因子mRNA表达水平在hep-mASCs中明显上调。肝脏- masc在皮肤组织中的积累多于单独的masc。与BLM-hep-mASC组比较,BLM-hep-mASC组皮肤厚度和羟脯氨酸含量显著降低,皮肤白细胞介素-2、α-平滑肌肌动蛋白、转化生长因子β1、1型胶原α- 1、金属蛋白酶组织抑制剂2 mRNA表达量显著下调。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

hep-mASCs比单独使用mASCs具有更高的抗炎和抗纤维化作用,可能是治疗SSc的有前途的候选者。gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

系统性硬化症(SSc)是一种难治性自身免疫性疾病,可引起全身器官的炎症、纤维化和血管内皮损伤[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba].SSc的主要皮肤症状是皮肤硬化和皮肤溃疡,影响患者的日常活动,降低生活质量[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba].对于SSc患者的皮肤病变,目前还没有确定的治疗方法。在许多病例中,经经验治疗的SSc是皮质类固醇和口服环磷酰胺、静脉注射环磷酰胺或霉酚酸酯[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba].抗纤维化药物,如吡非尼酮和尼特丹尼,据报道可抑制特发性肺纤维化患者的强迫肺活量下降[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,以及sc相关间质性肺病[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba].然而,这些治疗对SSc患者硬皮病的效果是有限的。此外,免疫抑制治疗引起的药物毒性会引起副作用,如感染、骨髓抑制、随后的恶性肿瘤和器官损伤。因此,有必要就SSc患者皮肤病变的疗效和耐受性方面开发更好的治疗方法。gydF4y2Ba

间充质干细胞(MSCs)在再生医学中被广泛研究,因为它们能够分化成各种间充质细胞,包括成骨细胞、脂肪细胞、肌细胞和软骨细胞[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba].这些细胞具有抗凋亡、抗炎和抗纤维化作用,以及调节免疫反应和修饰植入部位微环境的能力[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba].骨髓间充质干细胞也可以用作同种异体移植物,因为它们表达低水平的人类白细胞抗原I类和II类[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]并在静脉注射时耐受性良好[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba].除了骨髓外,最近的研究表明骨髓间充质干细胞可以从其他组织中获得,包括脐带血、胎盘和脂肪组织。脂肪来源间充质干细胞(ASCs)由于脂肪组织中含有大量的间充质干细胞,而且皮下脂肪组织容易接触,因此倍受关注。gydF4y2Ba

ASCs在免疫调节作用上优于其他类型的mscs——包括BM-MSCs:既抑制T细胞增殖,又抑制单核细胞向成熟树突状细胞的分化[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba],以及抑制B细胞的活化和免疫球蛋白的产生[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba].此外,ASCs在促血管生成、抗凋亡和抗氧化作用方面比其他MSCs更有效[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba].总的来说,这些发现表明ASCs可能比其他类型的MSCs更有效[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba].gydF4y2Ba

肝素是抗凝血酶III和Xa因子的抑制剂,用于预防和治疗血栓[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba].它与许多蛋白质相互作用,预计具有多方面的功效[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba].肝素稳定HGF二聚体以促进二聚体和c-Met受体的激活[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba].增强成纤维细胞生长因子和骨形态发生蛋白4基因表达,分别增加骨髓间充质干细胞和胚胎干细胞的增殖和多能性[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba].肝素刺激各种细胞中HGF的生物合成,如肺成纤维细胞、早幼粒细胞白血病细胞和脐静脉内皮细胞-这种刺激的详细机制尚不清楚[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba].正常肝素加速出血[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]而低分子肝素(LMWH)可减少出血[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba].此外,低分子肝素分泌HGF的能力与正常肝素相似[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba].gydF4y2Ba

本研究验证了lmwh激活的ASCs通过促进抗炎和抗纤维化作用对SSc具有协同有利作用的假设。研究低分子肝素对ASCs功能的影响,并在SSc小鼠模型中比较低分子肝素激活的ASCs与单独ASCs的治疗效果。gydF4y2Ba

材料和方法gydF4y2Ba

脂肪组织的收获,asc的分离和培养gydF4y2Ba

大阪医科大学动物护理和使用机构委员会批准了以下所有研究方案(批准ID: 21050-A),包括手术程序和动物护理,所有方法都按照相关指南和法规执行。小鼠维持在特定控制的无病原体环境中(温度,25°C;湿度、50 - 70%;明暗循环,12小时/12小时),免费提供食物和水。雌性8周龄Balb/c小鼠(SHIMIZU Laboratory Supplies, Kyoto, Japan)在异氟醚麻醉下颈椎脱位。脂肪组织来自腹股沟区域,并在所有实验中作为皮下脂肪组织使用。小鼠ASCs (masc)从每个脂肪组织样本中分离出来(如前所述),并稍加修饰[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba].简单地说,将脂肪组织放在收集管中,在磷酸盐缓冲盐水(PBS) (pH值7.4)中洗涤,并用细剪刀切成0.5-1.0 mm的小碎片。然后将组织转移到15毫升的试管中。然后将I型胶原酶(1.0 mg/mL 1% BSA/HBSS(+))以相同体积添加到管中。立即用水低音搅拌器(150 rpm)在37°C搅拌30分钟。消化后的组织用40 μm细胞过滤器过滤,200×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba吸取上清,将细胞颗粒重悬于红细胞裂解缓冲液(168 mM NH)中gydF4y2Ba4gydF4y2BaCl, 10 mM KHCOgydF4y2Ba3.gydF4y2Ba、0.1 mM EDTA-4Na;10 mL), 4℃静置10 min。红细胞裂解后,加入培养基5 mL, 200×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟。细胞颗粒重新悬浮在培养基中,并通过灭菌的100 μm和40 μm细胞过滤器(Corning Inc., NY, USA)过滤。培养并应用于第三代。gydF4y2Ba

细胞增殖实验gydF4y2Ba

masc以5000细胞/100 μL的密度播种到96孔板(康宁公司)的胶原包被孔中。在含有10% FBS和1.0% Pen-Strep的DMEM/F-12培养基中培养24小时,37℃,5% COgydF4y2Ba2gydF4y2Ba/ 95%空气气氛。将培养基更换为分别添加0、10、100 μg/mL低分子肝素的培养基,37℃培养24 h。用含WST-8 of Cell Count Reagent SF (10 μL)的100 μL新鲜培养基交换培养液,孵育30 min。在450nm波长处测定培养液的吸光度。细胞活力以百分比表示,与含10% FBS和1.0% p - strep的DMEM/F-12培养的细胞进行比较。这个实验对每个样本重复5次。gydF4y2Ba

细胞迁移试验gydF4y2Ba

用改进的Boyden腔法评价了masc的迁移活性。将masc(每孔5万个细胞)接种于24孔培养板的上孔,下孔分别注入含2% FBS和1.0% penp - strep的DMEM/F-12培养基,分别以0、1、10和100 μg/mL添加低分子肝素,37℃孵育6 h。用4 ',6-二胺基-2-苯基吲哚(DAPI)对迁移细胞进行染色,并在3个随机选择的高功率场(HPFs: ×200, 0.15 mm)中计数gydF4y2Ba2gydF4y2Ba每HPF)在荧光显微镜下的每个腔室,并计算得到的数字的平均值。每个样本独立进行了5次实验。gydF4y2Ba

胶质瘤免疫测定gydF4y2Ba

使用HGF ELISA量化因子试剂盒(R&D Systems Inc., MN, USA)按照制造商的方案评估上清液中的HGF含量。数据归一化为从细胞增殖试验中获得的相对细胞数。实验对每个样本分别进行了6次,并重复进行。gydF4y2Ba

利用masc进行实时逆转录pcr (RT-qPCR)gydF4y2Ba

在含有2% FBS和1.0% penp - strep的DMEM/F-12培养基中,以0、1、10或100 μg/mL低分子肝素的浓度进行培养,从中提取总RNA。使用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen Ltd., Manchester, UK)提取RNA后,使用ExScript RT试剂盒(Takara, Shiga, Japan)合成cDNA,并根据制造商说明在序列检测系统7000 (Applied Biosystems)中进行扩增。基质衍生因子-1 (SDF-1)、C-X-C趋化因子受体(CXCR) 4型(CXCR-4)、CXCR 7型(CXCR-7)和甘油醛6-磷酸脱氢酶(GAPDH)的引物序列汇总于表中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba.每个靶基因的表达归一化为管家基因的表达。实验重复三次,取结果的平均值。gydF4y2Ba

表1 RT-qPCR引物分析结果gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba

动物和实验组gydF4y2Ba

为诱导皮肤纤维化,8周龄雌性BALB/c小鼠背部皮肤剃毛,连续21天,小鼠每日皮下注射100 μg/100 μL博莱霉素(BLM) (Nippon Kayaku, Tokyo, Japan)无菌生理盐水[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba)(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba).用低分子肝素激活的masc (hep- masc)培养于含10% FBS和1.0%添加低分子肝素(10和100 μg/mL)的penp - strep的DMEM/F-12培养基中。在本研究中,为了评估hep-mASCs的效果,小鼠被分为以下组gydF4y2BangydF4y2Ba每组= 9例:blm诱导的SSc (blm单独)、blm诱导的SSc给予mASCs (BLM-mASC)、blm诱导的SSc给予10 μg/mL LMWH激活的mASCs (BLM-hep10-mASC)、blm诱导的SSc给予100 μg/mL LMWH激活的mASCs (BLM-hep100-mASC)。将含低分子肝素和不含低分子肝素的masc分别用100 μL PBS静脉注入尾静脉。blm单药组尾静脉静脉注射PBS 100 μL;给药细胞数为2.5 × 10gydF4y2Ba4gydF4y2Ba细胞。三种治疗均在BLM给药后第7天进行。给药后21天,对小鼠实施安乐死,取皮。gydF4y2Ba

组织学分析gydF4y2Ba

收集每只小鼠的背部皮肤,在4% PFA/PBS中固定6小时,然后在20%蔗糖/PBS中孵育一夜。将组织嵌入最佳切割温度的化合物(Sakura FineTek, Tokyo, Japan)中,切成5 μm切片,用苏木精和伊红(H&E)或马松三色染色。测量真皮层厚度以评估皮肤硬化。在每个切片随机选择10个点测量表皮-真皮交界处和真皮-脂肪交界处之间的距离,并取平均值。gydF4y2Ba

羟脯氨酸测定gydF4y2Ba

通过测定皮肤组织测定羟脯氨酸含量。每只BLM-SSc小鼠被注射的皮肤部位进行6 mm穿刺活检,保存在−70°C。每个样品用0.5 mol/L含醋酸的胃蛋白酶(0.3 mg/10 mg)在4℃下处理24 h。用Sircol测定皮肤组织中的羟脯氨酸含量gydF4y2BaTMgydF4y2Ba可溶性胶原蛋白检测试剂盒(Biocolor Ltd,北爱尔兰)。gydF4y2Ba

荧光免疫细胞化学gydF4y2Ba

皮肤切片用PBS清洗,样品在室温(RT)下被封闭在2% BSA/PBS的抗体稀释缓冲液中15分钟。去除阻塞液后,将主抗体/标记物添加到抗体稀释缓冲液中,37°C培养2小时:T淋巴细胞的抗cd3 (1:200) (eBioscience, San Diego, CA, USA);抗f4 /80抗体(1:200)(eBioscience)用于巨噬细胞。用PBS洗涤后,细胞在RT条件下与抗体稀释缓冲液中1:500制备的第二抗体:Alexa 594驴抗大鼠IgG (Jackson免疫研究实验室,Inc., West Grove, PA, USA)孵育30分钟。去除二抗后,再次用PBS洗涤组织,用4 ',6-二胺基-2-苯基吲哚(DAPI)溶液(1 μg/mL PBS)孵育核反染色;将一种安装培养基(ImmunoBioScience, Mukilteo, WA)添加到样本载玻片上,然后用盖片覆盖并用指甲油密封。然后在荧光显微镜下(BZx-700, Keyence, Osaka, Japan)进行评估。每个样品中的阳性染色细胞在5个不同的高功率场中计数(×200)。gydF4y2Ba

活体皮肤定量实时RT-PCRgydF4y2Ba

从BLM给药后21天采集的皮肤组织中提取总RNA。用RNeasy纤维组织小试剂盒(Qiagen Ltd.)提取RNA,合成并扩增cDNA。白细胞介素-2 (IL-2)、干扰素-γ (INF-γ)、白细胞介素-4 (IL-4)、白细胞介素-10 (IL-10)、白细胞介素-13 (IL-13)、白细胞介素-17 (IL-17)、白细胞介素-6 (IL-6)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子β1 (TGF-β1)、1型α- 1 (COL1α1)、金属蛋白酶组织抑制剂2 (TIMP-2)和GAPDH的引物序列汇总于表中gydF4y2Ba2gydF4y2Ba.GREM-1 (GREM-1)引物购自中国北京信和生物科技有限公司。实验重复三次,取结果的平均值。gydF4y2Ba

表2 RT-qPCR引物分析结果gydF4y2Ba

用皮肤进行Western blottinggydF4y2Ba

皮肤组织在添加蛋白酶抑制剂PMSF (0.1 mM)和磷酸酶抑制剂氟化钠(5 mM)的RIPA缓冲液中,用自动切片机(2组,每组2分钟,每分钟1500转/分钟)碾碎。gydF4y2Ba

使用量子比特蛋白质测定试剂盒(美国瑟默飞世尔科学公司,克利夫兰,OH, USA)分析蛋白质浓度。gydF4y2Ba

蛋白印迹检测使用Protein Simple WES系统(Protein Simple, SanJose, CA, USA),按照制造商提供的协议进行。一抗:抗smad2 /3 (1:20) (Cell Signaling Technologies, Danvers, MA, USA),抗phospho - smad2 /3 (1:20) (Cell Signaling Technologies),二抗:Anti-Rabbit secondary HRP Antibody (Protein Simple)。使用总蛋白检测模块(Protein Simple)将蛋白表达归一化为总蛋白。Simple Western数据使用Compass软件3.1版本(Protein Simple)进行分析。gydF4y2Ba

用于活体分析mASCs的生物发光成像gydF4y2Ba

用吲哚菁绿(ICG)在PBS (25 μM)中37°C孵育30 min,然后用PBS冲洗3次。研究了hep-mASCs在体内的迁移能力和分布。用低分子肝素(0、10、100 μg/mL)培养的icg标记的mascs在BLM给药一周后静脉注射到9只小鼠体内。给药24小时后,处死小鼠,取其皮肤、胸腺、脾脏、肺、心脏和肾脏。使用IVIS成像系统200系列(Calliper Life Science, Hopkinton, MA, USA)评估每个组织中的细胞聚集情况,并检测低分子肝素浓度对平均信号强度的影响。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

所有数值均以均数±均数标准误差(SEM)表示。两组的比较用曼-惠特尼量表进行gydF4y2BaUgydF4y2Ba多组间采用方差分析(ANOVA)检验显著性,随后采用Tukey程序进行事后检验。统计显著性设定为gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05。使用市售软件(GraphPad Prism, MDF Co. Ltd, Tokyo, Japan)进行统计分析。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

低分子肝素在体外增强了mASCs的细胞功能gydF4y2Ba

在低分子肝素存在的情况下,评估BALB/c小鼠mASCs的细胞功能。低分子肝素浓度间增殖活性无显著差异(图。gydF4y2Ba1gydF4y2BaA).与不含低分子肝素的mASCs相比,10和100 μg/mL低分子肝素的迁移活性显著增加(1 μg/mL低分子肝素的迁移活性没有增加)。gydF4y2Ba1gydF4y2BaB).添加1、10和100 μg/mL低分子肝素的巨噬细胞分泌的HGF量明显高于未添加低分子肝素的巨噬细胞(图)。gydF4y2Ba1gydF4y2BaC).与不含低分子肝素的mASCs相比,100 μg/mL低分子肝素的mASCs中趋化因子基质细胞衍生因子-1 (SDF-1)、C- x -C趋化因子受体4型(CXCR-4)和cxcr -7细胞迁移相关因子的mRNA表达显著上调(除1和10 μg/mL低分子肝素的mASCs外)。gydF4y2Ba1gydF4y2BaD-F)。gydF4y2Ba

图1gydF4y2Ba
图1gydF4y2Ba

不同浓度低分子肝素激活Balb/c小鼠mASCs的细胞功能。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba10和100 μg/mL低分子肝素显著提高了mscs的迁移活性,而1 μg/mL低分子肝素不提高mscs的迁移活性。gydF4y2BaBgydF4y2Ba不同浓度低分子肝素对masc增殖活性无显著影响。gydF4y2BaCgydF4y2Ba低分子肝素浓度为1、10和100 μg/mL时,masc分泌的HGF数量显著增加。gydF4y2BaD-FgydF4y2Ba趋化因子SDF-1、CXCR-4和CXCR-7的mRNA表达在100 μg/mL低分子肝素浓度下显著上调,而在1和10 μg/mL低分子肝素浓度下不上调。数据以均数±均数标准误差(SEM)表示。*gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05;**gydF4y2BaPgydF4y2Ba与不含LMWH的mASCs相比< 0.01gydF4y2Ba

BLM-SSc小鼠体内IVIS检测hep- masc在各器官的积累gydF4y2Ba

用ICG标记和IVIS系统评价10和100 μg/mL低分子肝素培养的mASCs在体内的迁移能力。数字gydF4y2Ba2gydF4y2BaA表示在不同低分子肝素浓度下,每个器官中icg标记的mASCs的积累。给药24小时后,10 μg/mL低分子肝素组与未加低分子肝素组相比,信号强度显著增加,而100 μg/mL低分子肝素组与未加低分子肝素组无显著差异。对于脾脏、胸腺、心脏、肺、肝脏和肾脏的信号强度,与不含低分子肝素的mASCs相比,低分子肝素的mASCs没有差异(图1)。gydF4y2Ba2gydF4y2BaB)。gydF4y2Ba

图2gydF4y2Ba
图2gydF4y2Ba

用IVIS系统评估不同低分子肝素浓度培养的mASCs在体内的迁移能力。gydF4y2Ba一个gydF4y2BamASC给药24 h后,各器官icg标记的mASC有代表性的积累图像。图像显示的最小-最大比例为4 × 10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba到2 × 10gydF4y2Ba7gydF4y2Ba光子/ s /厘米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba/球面度。gydF4y2BaBgydF4y2Ba10 μg/mL低分子肝素组皮肤信号强度显著增加,100 μg/mL低分子肝素组皮肤信号强度无显著差异。对于脾、胸腺、心脏、肺、肝脏和肾脏的信号强度,没有差异。数据以平均值±SEM表示。**gydF4y2BaPgydF4y2Ba与不含LMWH的mASCs相比< 0.01。Sk、皮肤;T,胸腺;Sp、脾;H,心;陆、肺;李、肝;K、肾脏gydF4y2Ba

Hep-mASCs可有效减少BLM-SSc小鼠皮肤纤维化gydF4y2Ba

增加的胶原沉积导致BLM-SSc皮肤纤维化,通过给药hep-mASCs可减少纤维化,而不给药低分子肝素的mASCs则不能减少纤维化。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaA). BLM-hep10-mASC组和BLM-hep100-mASC组皮肤纤维化厚度较blm -单用blm组明显降低,但BLM-mASC组无明显降低(图1)。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaB).通过测定羟脯氨酸含量来生物化学评估皮肤中的胶原蛋白沉积。BLM-hep10-mASC组和BLM-hep100-mASC组羟脯氨酸水平明显低于BLM-only组,但BLM-mASC组无差异(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaC)。gydF4y2Ba

图3gydF4y2Ba
图3gydF4y2Ba

给药后皮肤纤维化减轻。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba在开始BLM给药后21天,典型皮肤病变有苏木精伊红染色和马松三色染色(×100)。BLM-hep10-mASC组和BLM-hep100-mASC组皮肤胶原沉积增加减少,但BLM-mASC组没有减少。gydF4y2BaBgydF4y2BaBLM-hep10-mASC组和BLM-hep100-mASC组大鼠真皮层厚度(表皮-真皮连接处与真皮-脂肪连接处的距离)明显降低,但BLM-mASC组大鼠真皮层厚度没有降低。gydF4y2BaCgydF4y2BaBLM-hep-mASC组羟脯氨酸含量显著降低,BLM-mASC组羟脯氨酸含量不降低。BLM-hep10-mASC组和BLM-hep100-mASC组羟脯氨酸含量明显降低,但BLM-mASC组羟脯氨酸含量没有降低。gydF4y2BangydF4y2Ba每组= 7人。blm单药组尾静脉静脉注射PBS 100 μL;数据以平均值±SEM表示。*gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05;**gydF4y2BaPgydF4y2Ba与blm单药组相比< 0.01gydF4y2Ba

Hep-mASCs可减少BLM-SSc小鼠皮肤场炎症细胞的浸润gydF4y2Ba

与blm单药组相比,BLM-hep10-mASC组巨噬细胞和T淋巴细胞浸润有减少的趋势,而BLM-hep100-mASC组巨噬细胞和T淋巴细胞浸润减少更为明显(图1)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba).gydF4y2Ba

图4gydF4y2Ba
图4gydF4y2Ba

给药后皮肤炎症细胞浸润减少。与blm单药组相比,BLM-hep10-mASC组巨噬细胞和T淋巴细胞浸润有减少的趋势,而BLM-hep100-mASC组巨噬细胞和T淋巴细胞浸润减少更为明显。gydF4y2BangydF4y2Ba每组= 7人。数据以平均值±SEM表示。**gydF4y2BaPgydF4y2Ba与blm单药组相比< 0.01gydF4y2Ba

BLM-SSc小鼠皮肤组织炎症相关基因的表达水平通过给予低分子肝素激活的mASCs进行调控gydF4y2Ba

为了评价hep-mASCs的抗炎作用,采用qRT-PCR分析皮肤mRNA表达。BLM-hep10-mASC组和BLM-hep100-mASC组皮肤IL-2 mRNA表达水平较BLM-only组明显下调,但BLM-mASC组未下调。与单纯blm组相比,BLM-hep100-mASC组皮肤中IL-13和IL-17 mRNA表达水平明显下调,但BLM-mASC组和BLM-hep10-mASC组均未下调。各组间皮肤INF-γ、IL-4、IL-10、IL-6 mRNA表达水平无显著差异(图1)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba).gydF4y2Ba

图5gydF4y2Ba
图5gydF4y2Ba

与皮肤炎症相关的基因通过给药hep- masc进行调控。BLM-hep10-mASC组和BLM-hep100-mASC组皮肤IL-2 mRNA表达水平较BLM-only组明显下调。与BLM-hep100-mASC组相比,BLM-hep100-mASC组皮肤IL-13和IL-17 mRNA表达水平明显下调。gydF4y2BangydF4y2Ba每组= 7人。数据以平均值±SEM表示。*gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05;**gydF4y2BaPgydF4y2Ba与blm单药组相比< 0.01gydF4y2Ba

BLM-SSc小鼠皮肤组织纤维化相关基因的表达水平通过给予低分子肝素激活的mASCs进行调控gydF4y2Ba

为了评价hep-mASCs的抗纤维化作用,采用qRT-PCR分析皮肤mRNA表达。与BLM-mASC组比较,BLM-mASC组、BLM-hep10-mASC组和BLM-hep100-mASC组皮肤α-SMA、TGF-β1和COL1α1 mRNA表达水平明显下调。与BLM-mASC组相比,BLM-hep10-mASC组和BLM-hep100-mASC组皮肤TIMP-2 mRNA表达水平明显下调,但BLM-mASC组皮肤TIMP-2 mRNA表达水平未下调(图1)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba).两组间皮肤中GREM-1 mRNA表达水平无显著差异gydF4y2Ba2gydF4y2Ba).gydF4y2Ba

图6gydF4y2Ba
图6gydF4y2Ba

与皮肤纤维化相关的基因通过给药hep- masc进行调控。与BLM-mASC组比较,BLM-mASC组、BLM-hep10-mASC组和BLM-hep100-mASC组皮肤α-SMA、TGF-β1和COL1α1 mRNA表达水平明显下调。与BLM-mASC组比较,BLM-hep10-mASC组和BLM-hep100-mASC组皮肤TIMP-2 mRNA表达水平明显下调,而BLM-mASC组皮肤TIMP-2 mRNA表达水平未下调。gydF4y2BangydF4y2Ba每组= 7人。数据以平均值±SEM表示。*gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05;**gydF4y2BaPgydF4y2Ba与blm单药组相比< 0.01gydF4y2Ba

BLM-SSc小鼠皮肤中Smad2/3和Smad2/3的蛋白水平通过给予lmwh激活的masc进行调节gydF4y2Ba

为了评价TGF-β1在皮肤组织中的活性,采用western blotting法测定Smad 2/3和磷-Smad (p-Smad) 2/3蛋白水平。与BLM-mASC组相比,BLM-hep10-mASC组和BLM-hep100-mASC组的p-Smad 2明显降低,但BLM-mASC组的p-Smad 2没有降低。在BLM-mASC、BLM-hep10-mASC和BLM-hep100-mASC组中,Smad 2/3和p-Smad 3均较blm单药组有降低的趋势(图1)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba).gydF4y2Ba

图7gydF4y2Ba
图7gydF4y2Ba

皮肤组织中Smad 2/3和p-Smad 2/3的蛋白水平。western blotting法检测皮肤组织中Smad 2/3和p-Smad 2/3蛋白水平。与BLM-only组相比,BLM-hep10-mASC组和BLM-hep100-mASC组的p-Smad 2明显降低。gydF4y2BangydF4y2Ba每组= 5人。数据以平均值±SEM表示。*gydF4y2BaPgydF4y2Ba与blm单药组比较< 0.05gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

最近,Okamura等报道称,静脉给BLM-SSc模型和硬皮病慢性移植物抗宿主病模型mASCs后,皮肤纤维化被抑制[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba].在次氯酸诱导皮肤纤维化的小鼠模型中,系统给药人骨髓间充质干细胞和人ASCs的治疗效果比较也有报道[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba].与BM-MSCs相比,ASCs显著抑制真皮增厚,并下调炎性细胞因子和组织重构相关因子mrna的表达。在临床应用方面,Scuderi等人对6名SSc患者的面部或肢体病变部位进行了自体ASCs皮下注射,结果表明,该治疗减少了皮肤厚度,而没有引起任何局部并发症[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba].然而,据我们所知,目前还没有关于ASCs全身应用于SSc患者的报道。gydF4y2Ba

希望能提高给药ASCs对病变部位的迁移能力、抗炎症作用和抗纤维化作用。全身注射ASCs是获得其对SSc的充分作用的必要条件。为了获得足够的治疗效果,需要大量应用ASCs。然而,静脉注射ASCs引起的肺栓塞已有报道[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba],这阻碍了这种治疗方法的发展。与健康个体相比,SSc患者的asc增殖、代谢和趋化活性降低[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba].此外,SSc患者可能由于胃肠道功能障碍引起的营养紊乱而没有足够的脂肪[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba].如果能够增强ASCs的细胞功能,就有可能减少用于治疗的ASCs数量,并克服基础疾病导致的ASCs数量减少的问题。此外,当给予相同数量的细胞时,功能增强的ASCs被认为比正常的ASCs有更高的治疗效果。gydF4y2Ba

在本研究中,低分子肝素增强了巨噬细胞HGF的产生和巨噬细胞的迁移能力,并促进了细胞迁移因子SDF-1、CXCR4、CXCR7 mRNA的表达。由于10和100 μg/mL低分子肝素在体外显著增强了mASCs的迁移能力,因此在10和100 μg/mL低分子肝素的作用下研究了mASCs在体内的迁移能力。给药的masc具有迁移到炎症部位的能力[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba].在本研究中,当低分子肝素浓度为10 μg/mL时,mASCs在BLM-SSc小鼠皮肤损伤中积累。病变部位masc积累较多,低分子肝素增强,被认为是BLM-hep-mASC组疗效优于BLM-mASC组的原因之一。hep-mASCs对BLM-SSc小鼠的作用被认为是hep-mASCs在皮肤中积累的直接机制。此外,从累积在皮肤中的hep-mASCs释放的HGF的作用是可以预期的。gydF4y2Ba

在本研究中,皮肤病变中mASCs的积累程度与治疗效果存在差异。虽然原因不明,但认为hep100-mASCs在细胞功能的质量和数量上优于hep10-mASCs,不包括具有抗炎和抗纤维化作用的体液因子的迁移能力和分泌。此外,在hep100-mASC组中,masc迁移因子的基因表达最大化,但在hep10- masc组中,masc在皮损中的积累最大化。然而,masc的基因表达和功能并不一定与细胞迁移能力线性相关;还有许多其他因素,如其他趋化因子和生长因子。这些都有可能影响到低分子肝素对mASCs迁移功能的增强。为了进一步研究这一点,未来有必要更详细地研究低分子肝素对masc的影响。gydF4y2Ba

HGF激活c-Met受体,从而激活下游的PI3K/Akt和ERK1/2通路,通过下调NF-κB信号,减少IL-6分泌,增加IL-10分泌,促进Treg分化,发挥抗炎作用[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba,gydF4y2Ba42gydF4y2Ba].通过下调TGF-β信号,抑制成纤维细胞,增加基质金属蛋白酶9,降低金属蛋白酶1和2的组织抑制剂,发挥抗纤维化作用[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba,gydF4y2Ba44gydF4y2Ba,gydF4y2Ba45gydF4y2Ba].HGF对BLM-SSc小鼠的作用及对转染的BM-MSCs的抗炎和抗纤维化作用的增强gydF4y2BaHGFgydF4y2Ba基因已被报道[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba,gydF4y2Ba46gydF4y2Ba].gydF4y2Ba

TGF-β1通过Smad家族分子参与纤维化[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba].本研究通过测定皮肤组织中Smad 2/3和p-Smad 2/3的蛋白水平来评价TGF-β1的活性。结果表明,hep-mASCs显著降低BLM-SSc小鼠皮肤中的p-Smad2。这一结果表明,低分子肝素增加了mASCs中的HGF,通过降低TGF-β1活性和Smad信号通路来抑制纤维化。gydF4y2Ba

在本研究的BLM-mASC组中,单独使用mASCs对BLM-SSc小鼠皮肤纤维化无影响,而皮肤组织中纤维化合成因子mRNA表达受到抑制。怀疑是皮肤中没有积累足够数量的masc。初步实验证实了1.0 × 10的治疗效果gydF4y2Ba5gydF4y2Bamasc,它是目前研究中使用的细胞数量的四倍gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba).gydF4y2Ba

GREM-1是SSc中已知的促纤维化分子。有报道称IL-6信号通路增加了GREM-1的表达,导致纤维化[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba,gydF4y2Ba49gydF4y2Ba].据报道,IL-13在没有GREM-1的情况下参与纤维化[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba].皮肤纤维化也被认为是由Th2/Th17免疫极性介导的[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba].本研究中,与BLM-hep100-mASC组相比,BLM-hep100-mASC组皮肤中IL-13和IL-17 mRNA表达明显下调,而GREM-1和IL-6 mRNA表达不变。这些结果表明,hep-mASCs抑制纤维化的机制之一是修正Th2/Th17免疫极性,而这不是由IL-6或GREM-1介导的。gydF4y2Ba

本研究的一个局限性是我们只在一个模型中使用一株SSc进行了验证。在未来,这项研究应该扩展到包括其他品系,如紧皮小鼠。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

根据本研究的结果,hep-mASCs似乎比单独使用mASCs具有更高的抗炎和抗纤维化作用,可能是未来治疗SSc的有前途的候选者。本研究的结果显示了一种可能的方法,可以减少ASCs的数量和肺栓塞的风险,并提高治疗效果。需要开发进一步增强ASCs细胞功能的方法。gydF4y2Ba

数据和材料的可用性gydF4y2Ba

在当前研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。gydF4y2Ba

缩写gydF4y2Ba

SSc:gydF4y2Ba

系统性硬化病gydF4y2Ba

msc:gydF4y2Ba

间充质干细胞gydF4y2Ba

对asc:gydF4y2Ba

脂肪来源间充质干细胞gydF4y2Ba

mASCs:gydF4y2Ba

对asc鼠标gydF4y2Ba

LMWH:gydF4y2Ba

低分子量肝素gydF4y2Ba

hep-mASCs:gydF4y2Ba

低分子肝素激活的mascgydF4y2Ba

HGF:gydF4y2Ba

肝细胞生长因子gydF4y2Ba

BLM:gydF4y2Ba

博来霉素gydF4y2Ba

PBS:gydF4y2Ba

磷酸盐gydF4y2Ba

DAPI:gydF4y2Ba

4, 6-Diamidino-2-phenylindolegydF4y2Ba

SDF-1:gydF4y2Ba

基质衍生因子- 1gydF4y2Ba

cxcr:gydF4y2Ba

C-X-C趋化因子受体(CXCRgydF4y2Ba

CXCR-7:gydF4y2Ba

CXCR类型7gydF4y2Ba

2:gydF4y2Ba

白介素2gydF4y2Ba

il - 4:gydF4y2Ba

Interleukin-4gydF4y2Ba

il - 6:gydF4y2Ba

白细胞介素- 6gydF4y2Ba

il - 10:gydF4y2Ba

白细胞介素- 10”gydF4y2Ba

IL-13:gydF4y2Ba

Interleukin-13gydF4y2Ba

IL-17:gydF4y2Ba

Interleukin-17gydF4y2Ba

正-γ:gydF4y2Ba

移行细胞gydF4y2Ba

αsma:gydF4y2Ba

α平滑肌肉肌动蛋白gydF4y2Ba

转化生长因子-β1:gydF4y2Ba

转化生长因子β1gydF4y2Ba

COL1α1:gydF4y2Ba

1型α - 1胶原蛋白gydF4y2Ba

TIMP-2:gydF4y2Ba

金属蛋白酶组织抑制剂2gydF4y2Ba

GREM-1:gydF4y2Ba

Gremlin-1gydF4y2Ba

GAPDH:gydF4y2Ba

甘油醛6-phosphate脱氢酶gydF4y2Ba

p-Smad:gydF4y2Ba

Phospho-SmadgydF4y2Ba

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    文章gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

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我们感谢并感谢大阪医科和药科大学研究设备和装置学部的所有工作人员的帮助和支持。我们还要感谢鹤川纱织、高桥内奥米和铃木香织提供的技术援助。本研究得到大阪医科大学研究基地发展计划资助(OMPU内部研究资助)。我们要感谢Editage (gydF4y2Bawww.editage.comgydF4y2Ba)进行英文编辑。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

大阪医药大学研究基地发展项目资助(OMPU内部研究资助)。gydF4y2Ba

作者信息gydF4y2Ba

作者和联系gydF4y2Ba

作者gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

T. Suzuka和T. Kotani参与了研究设计、数据收集、研究执行、数据分析和解释以及手稿的准备。T. Saito参与了研究设计(体外实验和生物发光成像)、数据收集、研究执行、数据分析和稿件准备。竹内t起草并批准了手稿。所有作者已阅读并认可最终稿。资助机构在研究的设计中没有任何作用;在数据的收集、分析和解释中;或者在写手稿的时候。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaTakuya KotanigydF4y2Ba或gydF4y2Ba斋藤隆gydF4y2Ba.gydF4y2Ba

道德声明gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

大阪医科大学动物护理和使用机构委员会批准了以下所有研究方案(批准ID: 21050-A),包括手术程序和动物护理,所有方法都按照相关指南和法规执行。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者声明他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

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卡塔尔世界杯常规比赛时间施普林格自然对出版的地图和机构附属的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

补充信息gydF4y2Ba

额外的文件1。gydF4y2Ba

实验性的协议。为诱导皮肤纤维化,8周龄雌性Balb/c小鼠每日皮下注射博莱霉素100 μg/100 μL,连续3周。masc在博莱霉素开始使用1周后开始使用,并在3周时进行评估。mASCs:小鼠脂肪来源间充质干细胞。gydF4y2Ba

额外的文件2。gydF4y2Ba

实验数据。GREM-1和IL-6基因不受hep-ASCs的影响。皮肤中GREM-1和可诱导GREM-1的白细胞介素-6 mRNA表达水平各组间无显著差异。每组N = 7。数据以平均值±SEM表示。gydF4y2Ba

额外的文件3。gydF4y2Ba

实验数据。给药后皮肤纤维化减轻。1×10gydF4y2Ba5gydF4y2BamASCs显著降低了真皮厚度(表皮-真皮交界处和真皮-脂肪交界处之间的距离)和羟脯氨酸含量。每组N = 6。数据以平均值±SEM表示。**gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01。***gydF4y2BaPgydF4y2Ba与blm单药组相比< 0.005。gydF4y2Ba

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铃香,T,小谷,T,斋藤,T。gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba脂肪来源间充质干细胞/间质细胞通过低分子肝素增强迁移能力和肝细胞生长因子分泌对博莱霉素诱导的系统性硬化症小鼠模型的治疗作用gydF4y2Ba关节炎Res其他gydF4y2Ba24gydF4y2Ba228(2022)。https://doi.org/10.1186/s13075-022-02915-6gydF4y2Ba

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关键字gydF4y2Ba

  • 脂肪来源间充质干细胞/基质细胞gydF4y2Ba
  • 低分子量肝素gydF4y2Ba
  • 肝细胞生长因子gydF4y2Ba
  • 系统性硬化病gydF4y2Ba