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单细胞分析揭示了幼年特发性关节炎成纤维细胞样滑膜细胞的异质性,与疾病亚型有关

摘要

背景

成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)在JIA发病中起着至关重要的作用;然而,它们促进疾病进展的机制尚未得到很好的描述。先前的研究表明,类风湿关节炎FLS是异质的,具有转化、侵袭性表型的亚人群会导致侵袭性和破坏性疾病活动。我们使用单细胞rna测序(scRNA-seq)来研究JIA FLS的异质性和区分JIA亚型的基因表达。

方法

分别培养三种持续性少关节、三种预伸性少关节和三种多关节亚型的JIA FLS细胞系。scRNA-seq由Genewiz按照10 × Genomics Chromium协议进行。SeuratR包用于数据的QC、分析和探索。

结果

FLS是异质性的,具有成纤维细胞、软骨细胞和平滑肌细胞的特征。软骨细胞样亚群是主要的细胞类型,该亚群的百分比随着疾病的严重程度而增加。尽管有重叠的亚群,软骨细胞样细胞具有独特的遗传指纹,可以区分JIA亚型。LRRC15、GREM1和GREM2在持续性少关节型JIA FLS的软骨样细胞中过表达,而在前伸性少关节型JIA FLS中则是如此。S100A4、TIMP3和NBL1在预伸性少关节的JIA FLS中过表达,而在多关节的JIA FLS中过表达。相对于多关节的JIA FLS, CRLF1、MFAP5和TNXB在持续性少关节的JIA FLS中过表达。

结论

我们发现JIA亚型之间基因表达的生物学相关差异支持FLS在发病机制中的关键作用。我们还证明了软骨细胞样亚群内的基因表达可以用来区分这些亚型。

背景

幼年特发性关节炎(JIA)是儿童最常见的风湿病,具有永久性关节损伤和残疾的风险。目前JIA的分类方案根据发病分为7个亚型[1,2]。少关节亚型是最良性的,但当关节受累从少关节发展为多关节时,就会导致残疾,称为延伸性少关节病。在整个病程中,持续性少关节(oligo)最多可累及4个关节,而延伸性少关节在发病6个月后累计累及5个或更多关节[2]。21 - 50%的少关节起病患者延伸至多关节(poly)病程,其中只有13-23%的患者获得缓解[3.,4,5,6,7,8]。与持续性少关节病程或多关节起病的患者相比,延伸性少关节关节炎患者在与健康相关的生活质量评估中身体和心理得分最低[9], 38%的患者需要关节置换,而持续性少关节病程的患者只有13%需要关节置换[10]。

虽然JIA的发病机制尚不完全清楚,但人们认为成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)在JIA的进展中起着至关重要的作用,并可能在更严重的疾病形式中导致关节生长紊乱[11,12]。FLS种群中与疾病相关变化的潜在机制尚不清楚。FLS是来源于间充质干细胞的多能性细胞[13]。我们此前报道过,基于II型胶原、软骨寡聚基质蛋白、aggrecan和X型胶原等软骨标记物的mRNA和蛋白表达,JIA FLS具有软骨细胞样表型[11]。人滑膜细胞产生与软骨细胞相似的COMP和糖胺聚糖[14,15],在RA的瘤膜中发现了一种同时具有成纤维细胞和软骨细胞特征的成纤维细胞样细胞[16]。基于之前在RA的工作,我们表明FLS进化为软骨细胞样表型。

之前的工作使用了大体积RNA-seq来识别与疾病相关的FLS变化。这种策略并不能识别细胞的异质性,最近在RA方面的证据表明,FLS亚型对疾病进展的贡献不成比例。因此,我们假设JIA亚型可能与不同的细胞亚群相关。单细胞rna -测序(scRNA-seq)是一种在单细胞水平上对基因和转录物进行高通量测序和分析的技术。在本研究中,该技术被用于识别JIA FLS内的亚群,并显示JIA亚型之间以及亚型内细胞亚群之间的差异。我们知道RA中FLS之间存在异质性,可以通过单细胞rna测序检测到,并且这种异质性与疾病活动性有关[12,17,18,19,20.,21,22,23,24]。我们已经使用scRNA-seq在单细胞水平上分析了JIA FLS的转录组。使用阵列或大体积rna测序无法充分评估细胞间的变异。在扩展之前识别FLS群体的异质性不仅对理解这些细胞在扩展中的作用至关重要,而且对JIA的整体发病机制也至关重要。我们有趣的scRNA-seq数据展示了FLS的多个亚群,这让我们得出结论:利用scRNA-seq、基因组和转录组差异可以区分JIA亚型和亚型内的细胞亚群。这些数据可以用来理解这种疾病的复杂病理。

方法

样本的选择

滑膜液和滑膜组织样本来自我们的机构审查委员会批准的储存库。接受临床指征关节穿刺的患者被纳入储存库,并获得知情同意。我们从三名患有持续性少关节JIA的受试者中选择原代细胞;三名疾病扩展前的受试者,称为未扩展(ETB);三名多关节JIA患者。所有受试者之前没有注射过类固醇,也没有服用药物或只服用非甾体类抗炎药物。所有受试者都没有其他可能影响结果的病理或诊断。

细胞培养

9名受试者的滑膜液以300转/分离心5分钟。抽液,细胞球在FLS生长培养基(415-500 cell Applications, Inc.)中培养。当细胞在传代3处达到汇合时,抽液,细胞用胰蛋白酶处理并计数。一旦确定了细胞数量,细胞再次以300转/分旋转5分钟,并在含有10% DMSO的冷冻培养基中重新悬浮,稀释至2 × 106细胞,并以- 80的温度在细胞冷却器中保存4小时。然后将细胞保存在液氮中,直到运送到GENEWIZ。

单细胞RNA-sequencing

一旦细胞融合,它们将根据Azenta生命科学的一个部门GENEWIZ公司提供的协议被冷冻和运输,然后该公司根据制造商协议使用10 × Genomics Chromium进行scrna测序。简单地说,使用10 × Genomics Chromium在分割油滴时分离了细胞和条形码凝胶珠。逆转录结合了细胞和转录因子特异性的条形码。使用Illumina平台对条形码库进行汇总和测序[25]。

CellRanger总

CellRanger聚合用于组合来自每个生物样本的单个数据集。简单地说,来自单个JIA亚型的多个样本通过多个GEM井进行处理,生成多个库。这些库被汇集到一个流单元中。在多路复用后,CellRanger计数软件分别对每口GEM井运行。然后使用CellRanger聚合软件对数据进行聚合[26]。

放大镜细胞浏览器

使用CellRanger聚合生成的CLOUPE文件,分析每个JIA亚型的成纤维细胞标记物表达。基因或特征表达导入每个感兴趣基因的log2表达水平,并提供细胞号。细胞百分比是根据总细胞数计算的。

修拉的分析

进行Seurat分析。每组重复被用作Seurat数据分析包的单独输入。使用Seurat数据分析包对样本进行集成。数据的预处理包括全部表达式归一化和去除不必要的变异源。Seurat应用基于图的聚类方法将细胞划分为“群体”。当Seurat执行tSNE降维时,基于图的聚类被期望在投影中共同定位。对于每个样本中的每个聚类,计算阳性差异表达基因,并在tSNE投影上可视化它们的相对表达水平。执行“roc”检验,并根据AUC对得到的基因进行排序。使用Bioconductor的SingleR数据包自动对细胞进行注释。给定一个具有已知标签的细胞参考数据集(在本例中为Human Primary Cell Atlas Data),它会根据与参考集的相似性为来自测试数据集的新细胞进行标记。 Seurat is then used to integrate the sample datasets based on common sources of variation, enabling the identification of shared populations across data sets and downstream comparative analysis. Positive differentially expressed genes are also calculated for each cluster between conditions. This allows the identification of differentially expressed markers across conditions. Seurat provided cell percentages used for each comparison.

结果

尽管FLS具有异质性,但大多数总细胞仍保留成纤维细胞特征

我们建立了总细胞群的完整性。FLS是多能性细胞。为了进一步证明这些细胞在分析前的初始输入都是成纤维细胞,并且在细胞的亚型和亚群之间具有真正的异质性,我们使用Loupe Cell Browser叠加了通用标记,并计算了表达一组成纤维细胞标记的总细胞的百分比。Muhl等人基于文献建立了一组标记,因为没有单一的转录本可作为通用的成纤维细胞标记[27]。作为一个群体,这些标记可以识别总体细胞群中的成纤维细胞(LUM, LOXL1, COL1A1, COL5A1, PDFGRA, COL1A2, FBLN1, FBLN2,和CD34)。需要从几个标记中选择的转录本来稳稳地将成纤维细胞与其他亚群区分开来。

我们确定92%的寡关节(oligo) JIA FLS表达成纤维细胞标记物,90%的before to extend (ETB) JIA FLS表达成纤维细胞标记物,94%的聚JIA FLS表达成纤维细胞标记物(图。1A).热图提供了单个成纤维细胞标记物的表达及其在单个细胞簇中的表达模式的可视化(图。1B).重要的是要注意,FLS是通过这些特定基因的上调和下调来识别的,我们确认没有单一的标记可以用来识别FLS,但这些标记的组合可以区分这种细胞类型(图。1B).这一数据证实了总的JIA FLS确实是纤维母细胞样滑膜细胞。所有的细胞簇都有成纤维细胞标记的表达。虽然我们确定了我们最初的总细胞输入有成纤维细胞起源,但当我们比较JIA的亚型时,下面的scRNA-seq分析将揭示这些细胞是异质的。此外,在每个亚型中,都有保守的细胞亚群,这些亚群为JIA FLS的遗传指纹提供了另一层异质性。

图1
图1

通用成纤维细胞标记物的表达。标记包括FBLN1、FBLN2、PDGFRA、COL1A2、COL5A1、COL1A1、LOXL1、LUM和CD34。确定92%的寡关节型JIA FLS表达成纤维细胞标记,90%的ETB型JIA FLS表达成纤维细胞标记,94%的聚型JIA FLS表达成纤维细胞标记(一个),证明我们的初始总细胞输入有成纤维细胞起源。热图提供了单个成纤维细胞标记的表达及其在单个细胞簇中的表达模式的可视化(B)。这些标记在单个簇中表达上调和下调的组合定义了成纤维细胞

尽管所有JIA亚型的初始输入都使用单细胞类型,但疾病亚型之间存在异质性

CellRanger聚合在单个JIA子类型上执行,将数据集聚合为单个输出,用于多样本分析。数字2A提供了数据输入和下游分析的流程图。首先,我们分析了JIA亚型之间的总体差异,寡关节型JIA (oligo)、伸直型JIA (ETB)和多关节型JIA (poly)。热图揭示了30个顶级可变基因,它们在单细胞之间的亚型中表现出异质性(图1)。2B).这些基因具有最大的差异表达,并解释了每个JIA亚型内单细胞间的细胞分散。当比较特定的基因时,来自oligo的细胞内有16个独特的差异表达基因,来自ETB的细胞内有22个独特的差异表达基因,来自poly的细胞内有15个独特的差异表达基因(图1)。2C).在比较亚型时,oligo和ETB之间有4个基因重叠(图5)。2C).值得注意的是,FBLN1表达差异。在寡聚和多聚重叠的11个基因中,S100A4存在差异表达,COMP和TIMP1也存在差异表达(图1)。2C). ETB和poly之间有6个基因重叠。从这个列表中,COL3A1、HAPLN1和SFRP4在每个亚型的单细胞内表达差异(图。2C)。

图2
图2

FLS的异类。初始数据输入和处理的工作流图,以提供数据如何处理的摘要(一个)。热图揭示了单细胞内差异表达最大的30个顶级可变基因(B)。在这30个基因中,有16个独特的差异表达基因来自oligo, 22个独特的差异表达基因来自ETB, 15个独特的差异表达基因来自poly (C)。oligo和ETB之间有4个基因重叠,oligo和poly之间有11个基因重叠,ETB和poly之间有6个基因重叠(C)。这些基因可以用来区分JIA亚型

FLS最显著的聚类亚群共同定位在一起,但随着病程变得更严重,聚类分散增加

每组重复被用作来自Bioconductor的Seurat数据分析包的单独输入。无论JIA亚型如何,FLS都分离成可区分的细胞亚群社区,这些亚群的基因表达不同。尽管使用单细胞类型FLS作为初始输入,单个细胞分离成不同的细胞亚群集群,这些细胞亚群的基因表达模式各不相同(图1)。3.A).虽然一个簇内的细胞具有相似的表达模式,但也有一些细胞组与其相邻的簇具有不同的表达模式,说明FLS是异质性的。

图3
图3

集群扩散随疾病病程的严重程度而增加。在ETB样本中,少关节细胞大多聚集在一起并开始分离。在多关节样本中可见到最大的分散(一个)。使用Bioconductor的SingleR数据包自动对细胞进行注释。JIA亚型之间的共享种群包括成纤维细胞样细胞、软骨细胞样细胞和平滑肌细胞样细胞,以及较小的亚种群(B)。Seurat单次分析确定了每种亚型的每种预测细胞类型的顶级基因。这些基因是细胞间变异的最大贡献者。对细胞间变异贡献最大的基因如下:oligo - COL1A1、mtnd1、TUBA1B、ACAN和IFI27;ETB - MTRNR2LB、SERPINE1、TOP2A、MEG3、COL3A1和VCAM;poly - ACP5, SPP1, TNFAIP6, IGFBP5, AKAP12, MFAP5,和S100A4 (C

对于少关节的JIA FLS样本,所有的群落共同定位在一起,第4个簇轻微分离(图4)。3.A). ETB JIA FLS样品有更多的簇4、簇5和簇6分离,而多关节JIA FLS样品的细胞群落间分离最多(图5)。3.A). FLS异质性的增加与细胞簇间的分散有关,这种分离对应于更严重的疾病病程的进展。

细胞簇被确定为已知细胞类型的各种亚群

我们使用无偏聚类,因为对FLS亚型中的标记基因知之甚少。为了验证,我们使用Bioconductor的SingleR数据包自动对细胞进行注释。Seurat单分析用于分析JIA亚型,并识别跨数据集和下游比较分析的共享种群。在这些共享群体中,有成纤维细胞样细胞、软骨细胞样细胞和平滑肌细胞样细胞(图。3.B).其他较小的亚群包括成骨细胞和间充质干细胞(图6)。3.B)。

识别负责细胞在亚型间分散的顶级基因,意味着JIA亚型内细胞亚群之间的转录组差异

Seurat单次分析确定了每种亚型的每种预测细胞类型的顶级基因。点图提供了每个细胞类型中每个基因的平均表达的可视化,以及表达该基因的细胞的百分比(图。3.C)。这些基因是细胞间变异的最大贡献者。对细胞间变异贡献最大的基因如下:oligo - COL1A1、mtnd1、TUBA1B、ACAN和IFI27;ETB - MTRNR2LB、SERPINE1、TOP2A、MEG3、COL3A1和VCAM;以及poly - ACP5、SPP1、TNFAIP6、IGFBP5、AKAP12、MFAP5和S100A4(图4)。3.C).这些基因中有几个编码与肌肉骨骼和发育性疾病有关的表面和分泌蛋白。

被确定为软骨细胞的细胞是大多数细胞型亚群,多关节的JIA FLS拥有最大比例的软骨细胞

虽然确定了许多细胞亚群,但在JIA亚型中最密集的三个细胞型亚群被确定为软骨细胞样细胞、成纤维细胞样细胞和平滑肌细胞样细胞(图4)。4A).随着细胞向更多软骨细胞样特征进化,随着病程变得更加严重,它们的成纤维细胞样细胞亚群和平滑肌细胞样亚群减少,特别是在少关节的JIA FLS和多关节的JIA FLS样本之间(图。4B)。

图4
图4

在JIA亚型中,最密集的三个细胞型亚群被确定为软骨细胞样、成纤维细胞样和平滑肌细胞样细胞。对于少关节的JIA FLS样本,38%的总细胞被标记为软骨细胞样,24.5%的总细胞代表成纤维细胞样细胞,22.5%构成平滑肌细胞样细胞亚群(一个)。在ETB JIA FLS样本组中,39%的细胞被鉴定为软骨细胞样,28%的细胞被标记为成纤维细胞样,10%的细胞由平滑肌细胞样细胞组成(一个)。最后,多关节JIA FLS有71%的细胞是软骨细胞样的,12%的细胞是成纤维细胞样的,5%的细胞被标记为平滑肌细胞样的(一个)。在少关节JIA FLS和多关节JIA FLS样品之间,平滑肌细胞样细胞减少了−8.89倍(^p= 0.0001) (B)。成纤维细胞样细胞百分比在ETB型JIA FLS中明显高于低关节型JIA FLS (*p= 0.0297) (B)。多关节的JIA FLS与少关节的JIA FLS相比,软骨细胞样细胞百分比显著增加(^p= 0.0006)和ETB JIA FLS (φp= 0.0044) (B

JIA FLS的异质性持续存在于JIA亚型的细胞亚群内的差异基因表达

JIA亚型之间最突出的亚群是相同的:软骨细胞样细胞、成纤维细胞样细胞、平滑肌细胞样细胞;然而,转录本分析揭示了JIA亚型之间这些亚群的基因表达差异。Seurat单分析确定了每个JIA亚型的每个预测聚类或细胞亚群的顶级差异基因(图。5A).进一步分析发现JIA亚型之间的软骨细胞样亚群基因表有重叠。通过去除重叠基因,我们发现了JIA亚型之间区分软骨细胞样亚群的独特基因(补充表1)。

图5
图5

每个亚群体的最高上调基因。寡关节JIA软骨细胞中表达的基因为COL6A3(65.1%)、COL3A1(66.8%)和MMP2 (85.5%) (一个)。ETB JIA软骨细胞中表达比例最大的基因为NEAT1(99.2%)、PCOLCE(83.7%)和MEG3 (86.7%) (一个)。多关节JIA软骨细胞中表达比例最大的基因为CCDC80(99.7%)、COMP(72.8%)和CHI3L1 (93.9%) (一个)。寡关节JIA成纤维细胞中表达的基因为MYL12A(74.5%)、IGFBP7(82.9%)和LOX (77.5%) (B)。ETB JIA成纤维细胞中表达的基因为CCND1(74%)、FTH1(99.8%)和FTL (99.7%) (B)。多关节JIA成纤维细胞中表达的基因分别为IFI27(81.1%)、MFAP5(81.8%)和S100A4 (93.8%) (B)。少关节JIA FLS平滑肌细胞样基因表达为CAV1(67.5%)、FTL(99.9%)和TMSB4X (98.8%) (C)。在JIA FLS中表达的平滑肌细胞样基因为SERPINE2(86.7%)、CCND1(79.7%)和GREM1 (58.3%) (C)。多关节JIA平滑肌细胞样细胞中表达的基因为AKAP12(62%)、CAV1(80.2%)、S100A4 (72.2%) (C)。p-值均< 0.01

在分析JIA亚型内成纤维细胞样细胞和平滑肌细胞样细胞亚群的基因表达时,我们发现了在JIA亚型之间区分成纤维细胞样亚群和平滑肌细胞样亚群的独特基因(图。5B, C;补充表2)。

考虑到JIA FLS的软骨细胞样细胞簇是跨JIA亚型的优势亚群,这些细胞中独特基因的表达可以区分JIA亚型。虽然许多基因重叠,但该亚群的独特遗传指纹表明,即使在一个单一的均匀软骨细胞样细胞簇中,JIA亚型之间也存在异质性。这促使我们仔细检查每个JIA亚型内的软骨细胞样亚群的转录组。

对软骨细胞样亚群的进一步分析揭示了促进JIA病理的生物学相关证据

Seurat综合分析允许JIA亚型之间的比较。这种分析为每个JIA亚型识别出每个预测细胞亚群的顶级差异基因,并使我们能够确定不仅能区分JIA亚型的亚群,而且还能区分JIA亚型本身的基因。还计算了亚型之间每个亚群的阳性差异表达基因。这样就可以识别JIA亚型间的差异表达标记。

当比较ETB JIA FLS的软骨细胞样亚群和oligo JIA FLS的软骨细胞样亚群时,有211个差异表达基因(补充表3.)。在这些基因中,与ETB相比,82个基因在oligo中表达上调,129个基因在ETB中表达上调。匠心途径分析(IPA)揭示了与该基因列表相关的顶级疾病和障碍:癌症、有机体损伤和异常、胃肠道疾病和免疫疾病。这些疾病和紊乱与细胞运动、细胞死亡、细胞增殖和细胞功能相关。该亚群中差异表达最多的3个基因是LRRC15、MTRNR2L1和GREM2(图。6)。在这一比较中,LRRC15在寡聚JIA FLS中35.8%的软骨细胞样细胞中表达,而在ETB JIA FLS中仅表达6.1%的软骨细胞样细胞。67.3%的oligo JIA FLS软骨样细胞表达GREM1,而ETB JIA FLS中34.8%的软骨样细胞表达GREM1。GREM2在低聚JIA FLS中45.8%的软骨细胞样细胞中表达,而在ETB JIA FLS中表达的软骨细胞样细胞为11.5%。

图6
图6

JIA亚型之间的软骨细胞样细胞亚群。LRRC15在oligo JIA FLS中表达35.8%,在ETB JIA FLS中表达6.1%。在oligo JIA FLS中67.3%的软骨样细胞表达GREM1,而在ETB JIA FLS中这一比例为34.8%。GREM2在oligo JIA FLS中45.8%的软骨样细胞中表达,而在ETB JIA FLS中则为11.5% (一个)。在ETB JIA FLS中,S100A4在89.6%的软骨细胞样细胞中表达,而在poly JIA FLS中,这一比例为39%。75.8%的ETB JIA FLS软骨样细胞表达TIMP3,而聚JIA FLS表达TIMP3的比例为48.2%。ETB JIA FLS中72.4%的软骨样细胞表达NBL1,而聚JIA FLS中40.7%的亚群表达NBL1 (B)。CRLF1在低聚JIA FLS中表达于63.1%的软骨细胞样细胞中,而在多聚JIA FLS中表达于29.2%。低聚JIA FLS中58.7%的软骨样细胞表达MFAP5,而多聚JIA FLS中表达MFAP5的比例为19.7%。TNXB在寡聚JIA FLS中表达率为44.6%,而在多聚JIA FLS中表达率为11.6% (C)。p-值均< 0.01

当比较ETB JIA FLS的软骨细胞样亚群和poly JIA FLS的软骨细胞样亚群时,有440个差异表达基因(补充表4)。在这些基因中,与ETB相比,有167个基因在poly中表达上调,而与poly相比,有273个基因在ETB中表达上调。IPA揭示了与该基因列表相关的顶级疾病和障碍:骨关节炎、结缔组织疾病、炎症性疾病以及骨骼和肌肉疾病。这些疾病和紊乱与细胞运动、细胞死亡、细胞增殖和细胞功能相关。该亚群中差异表达最多的3个基因是S100A4、TIMP3和NBL1(图4)。6)。在这一比较中,ETB JIA FLS中89.6%的软骨细胞样细胞表达S100A4,而poly JIA FLS中39%的软骨细胞样细胞表达S100A4。ETB JIA FLS中75.8%的软骨样细胞表达TIMP3,而聚JIA FLS中48.2%的软骨样细胞表达TIMP3。ETB JIA FLS中72.4%的软骨样细胞表达NBL1,而聚JIA FLS中40.7%的软骨样细胞表达NBL1。

当比较来自寡聚JIA FLS的软骨细胞样亚群和来自多聚JIA FLS的软骨细胞样亚群时,有266个差异表达基因(补充表5)。在这些基因中,与寡聚基因相比,聚中124个基因上调,寡聚基因相比聚中142个基因上调。IPA揭示了与该基因列表相关的顶级疾病和障碍:癌症、有机体损伤和异常、胃肠道疾病和结缔组织疾病。这些疾病和紊乱与细胞运动、细胞死亡、细胞增殖和细胞功能相关。该亚群中差异表达前3位的基因是CRLF1、MFAP5和TNXB(图。6)。在这一比较中,低聚JIA FLS中63.1%的软骨细胞样细胞表达CRLF1,而多聚JIA FLS中有29.2%的软骨细胞样细胞表达CRLF1。低聚JIA FLS中58.7%的软骨样细胞表达MFAP5,而多聚JIA FLS中19.7%的软骨样细胞表达MFAP5。TNXB在低聚JIA FLS中44.6%的软骨样细胞中表达,而在多聚JIA FLS中,这一比例为11.6%。软骨细胞样亚群内独特的遗传指纹可用于进一步区分JIA亚型。

讨论

尽管滑膜成纤维细胞是关节发育的主要细胞类型,但对其在JIA发病机制中的作用仍知之甚少。在本研究中,我们不仅揭示了JIA亚型之间的异质性,而且利用scrna -测序揭示了JIA亚型内亚群体的差异遗传组成。在这里,我们从少关节的、将来伸展的和多关节的JIA描述了FLS。我们提供了广泛的基因标记,描述表达的相似性,以定义成纤维细胞,以及基因表达的亚型内和亚群内异质性,从而区分我们感兴趣的亚型和这些JIA亚型的软骨细胞样亚群。

据我们所知,这是第一项使用scrna测序专门检测从幼年特发性关节炎患者分离的成纤维细胞样滑膜细胞的研究。尽管JIA中关于这一主题的文献极少,但已发表的文献确实支持类风湿关节炎(RA)中FLS的异质性,例如FLS的亚群中存在p53突变[18和某些FLS亚群与疾病活动有关[21,22,23]。这些先前的研究强调了FLS之间异质性的存在,以及这些细胞在RA侵袭性破坏过程中的重要性。对JIA中FLS的检查及其与疾病进展的关系,文献中未见报道。像这样深入的转录组分析的进一步探索,可以揭示差异表达的基因不仅有助于JIA的整体发病机制,而且还可以揭示FLS亚群内基因表达的差异如何揭示JIA亚型之间的全面差异。

在这项研究中,我们表明JIA FLS是异质性的,并且这种异质性通过几层基因分析持续存在。我们检测了单细胞间JIA亚型内表现异质性的前30个可变基因。值得注意的是,骨关节炎软骨细胞增殖的标记物FBLN1 [28],在寡关节FLS和ETB FLS之间差异表达。在比较低聚FLS和多聚FLS时,成纤维细胞的一个特征良好的标记物S100A4以及COMP和TIMP1表达差异。COMP是RA中软骨翻转的标志[29而TIMP1则抑制降解细胞外基质的金属蛋白酶。在ETB和poly之间,COL3A1, HAPLN1和SFRP4在不同亚型的单细胞内表达差异。COL3A1基因的突变与关节炎和骨骼疾病有关[30.]。HAPLN1与RA有关[31]。SFRP4抑制RA的疾病调节通路Wnt信号[32]。这些蛋白由软骨细胞表达,是软骨发育的关键,支持了我们的数据,即软骨细胞样细胞是所有JIA亚型中的主要细胞亚群。

有趣的是,随着病程的加重,细胞的弥散度增大,细胞变得更像软骨细胞。Mizoguchi等人发现,FLS的不同亚群在RA的关节破坏中发挥着不同的作用[22]。生长障碍常见于JIA患者的关节。Gaspari等人认为JIA FLS表达的促炎蛋白可直接影响生长板软骨细胞,导致JIA中观察到的关节生长障碍[33]。我们自己的研究表明,JIA FLS具有软骨细胞样特征[11]。这一发现反映在我们目前的scrna测序研究中。随着疾病向多关节发展,FLS变得更像软骨细胞,而更不像成纤维细胞或平滑肌细胞。FLS变得更软骨细胞样可能导致JIA中观察到的关节生长紊乱。

尽管JIA亚型内的细胞亚群保持保守,但我们发现JIA亚型间的软骨细胞样亚群存在显著的转录组差异,这表明在JIA FLS中观察到的异质性存在另一层。具体来说,与ETB JIA FLS相比,GREM1和GREM2在oligo JIA FLS的软骨细胞样细胞中过表达的比例更高。GREM1和GREM2是BMP拮抗剂,也是TGFβ超家族的成员,TGFβ超家族是在软骨细胞分化中发挥关键作用的信号通路[34,35]。S100A4和TIMP3在ETB和poly JIA FLS中表达差异。最近在RA患者滑膜成纤维细胞增殖和滑膜组织中发现S100A4表达增加[36]。TIMP3是一种金属蛋白酶抑制剂,其家族成员可以阻止MMPs降解软骨中的细胞外基质,这是慢性风湿性炎症疾病的一个特征[37]。CRLF1和MFAP5在聚JIA FLS中的总细胞百分比表达低于寡聚JIA FLS。CRLF1表达的抑制导致间充质干细胞分化为软骨细胞[38]。MFAP5促进肿瘤细胞增殖,并与ERK/MMP信号通路相互作用[39]。在细胞过程中起作用的基因的差异表达支持了我们在IPA中发现的结果,即软骨细胞样亚群基因组促进细胞运动、细胞增殖和细胞功能。虽然正常软骨细胞的基因表达存在共性,如细胞外基质相关基因、调节软骨形成的基因和来自TGFβ超家族的基因,但这些差异可能对JIA亚型之间的软骨细胞样FLS具有致病意义。也就是说,较轻的JIA亚型(寡聚型和伸前型)表达的基因减弱了细胞外基质的破坏,而来自聚JIA FLS的软骨细胞样细胞下调了对关节发育和胶原形成更具体的基因的表达。

本研究的局限性在于样本数较少。尽管样本数量有限,但我们发现JIA亚型之间的生物学相关差异支持了FLS的关键作用。我们还证明了软骨细胞样细胞亚群可以用来区分这些亚型。具体来说,ETB有一个独特的遗传指纹,可以在扩展到更严重的疾病过程之前识别出来,随着患者发展到多关节过程,FLS变得越来越像软骨细胞。诸如此类的scrna测序文库为未来进一步阐明FLS在幼年特发性关节炎疾病进展和发病机制中的作用的研究提供了敲门石。

结论

我们确定,在空间上,随着病程的进展,物理细胞退化为更多的簇,其中少关节的JIA FLS具有最少的细胞簇和簇间重叠最多的细胞簇,而多关节的JIA FLS具有最多的簇和簇间距离最大的细胞簇。我们还发现,标注的细胞簇显示了几种细胞类型。这些细胞亚群保存在JIA亚型中,其中最多的细胞被鉴定为软骨细胞样细胞、成纤维细胞样细胞和平滑肌细胞样细胞;然而,这些亚群的百分比会随着疾病的严重程度而变化。在所有JIA亚型中,总细胞百分比最高的是软骨细胞样细胞;然而,多关节的JIA FLS有最大比例的这些细胞,这表明随着疾病的进展,JIA FLS变得更软骨细胞样。在软骨细胞样细胞亚群内,异质性仍然存在。在每个软骨细胞样亚群中都表达了独特的基因,并且根据所分析的JIA亚型而有所不同。这个细胞亚群的独特基因表达谱可以区分JIA亚型。

数据和材料的可用性

本研究中使用和/或分析的数据集可在本稿件中作为补充材料。其他数据可根据合理要求从通讯作者处获得。

缩写

贾:

青少年特发性关节炎

益生元:

持久oligoarticular贾

ETB:

Extend-to-be oligoarticular贾

保利:

Polyarticular贾

读者:

呈synoviocytes

scRNA-seq:

单细胞RNA-sequencing

异丙醇:

创新途径分析

类风湿性关节炎:

类风湿性关节炎

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确认

没有提及。

资金

这项工作得到了南希·泰勒慢性疾病基金会(3205042005)的支持,以及特拉华社区基金会和开放网络基金会的捐赠。没有来自商业来源的资金支持,也没有可能与作者产生利益冲突的经济利益。

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贡献

MS进行了实验,对所有提出的数据进行了数据分析,并为手稿的撰写做出了贡献。KS作为这个项目的导师,对手稿提供编辑反馈,以及对实验方法的科学投入。AB是资深作者,也是这个实验室的主要研究员。她为这篇稿件的数据分析、实验讨论和撰写做出了贡献。所有作者都审阅了这篇稿件。作者们阅读并批准了最终稿。

相应的作者

对应到梅根·m·西蒙茨

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伦理审批并同意参与

滑液来自内摩尔基金会生物医学研究机构审查委员会(IRB# 84709-30)批准的储藏库。接受临床指征关节穿刺的患者被纳入储存库,并获得书面知情同意。

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Simonds, m.m., Sullivan, K.E. & Brescia, A.C.:单细胞分析揭示了幼年特发性关节炎成纤维细胞样滑膜细胞的异质性,与疾病亚型有关。关节炎Res其他24225(2022)。https://doi.org/10.1186/s13075-022-02913-8

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关键字

  • 青少年特发性关节炎
  • 呈synoviocytes
  • 软骨细胞
  • 基因组学