DNA双加氧酶10 - 11易位3 (TET3)在类风湿性关节炎进展中的作用

背景

类风湿性关节炎(RA)患者的成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)存在异常的甲基化模式。鉴于DNA去甲基化对产生DNA甲基化模式至关重要，我们假设DNA去甲基化可能促进RA的进展。因此，本研究旨在探讨DNA双加氧酶家族ten - 11易位(TET1/2/3)在RA病理过程中的作用。

方法

滑膜组织和FLS取自风湿性关节炎和骨关节炎患者。K/BxN血清诱导性关节炎在野生型(WT)和TET3heterozygous-deficient (TET3^{+ /−}) C57BL / 6小鼠。

结果

我们发现TET3和5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)在RA患者滑膜炎组织中均表达上调，并在滑膜炎组织培养的FLS中证实了这一上调。肿瘤坏死因子α (TNFα)上调培养的FLS中TET3和5hmC的水平，刺激的FLS表现出较高的细胞移动性，细胞迁移相关因子如C-X-C基序趋化因子配体8 (CXCL8)和C-C基序趋化因子配体2 (CCL2)的转录增加，且具有TET3依赖性。此外,TET3单倍不足降低血清关节炎小鼠模型的RA进展。

结论

基于这些发现，我们可以假设tet3介导的DNA去甲基化作为RA进展的表观遗传调控因子。

在类风湿关节炎(RA)中，针对某些负责免疫和炎症的分子使用抗风湿药物治疗往往能有效改善症状，这取决于其病理背景。然而，只有大约一半接受这些治疗的患者出现缓解[1］．这些事实表明，持续的炎症会加重类风湿性关节炎的进展，迫使其过渡到不可逆转的状态，并使患者超过不可逆转的临界点[2，3.，4］．

成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)是滑膜膜形成的关键细胞。RA滑膜组织中的FLS似乎转变为部分转化细胞，具有高敏感表型[5］．染色质状态决定了表型，并通过DNA甲基化和组蛋白修饰进行调节[6，7］．DNA甲基化通过DNA去甲基化和再甲基化调节[7］．在DNA再甲基化中，DNA甲基转移酶(DNMTs)负责从头甲基化和甲基化维持。DNA去甲基化包括被动去甲基化和主动去甲基化[7］．10 - 11易位(TET)蛋白是活性去甲基化酶，首先氧化甲基化胞嘧啶(5-甲基胞嘧啶(5mC))为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)、5-甲酰胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)。

全基因组无偏性研究表明，RA患者激活的FLS存在DNA甲基化异常模式[8，9，10，11，12，13]，并且有人认为这些异常可能与更具侵袭性的表型有关[12］．此外，我们还发现在肿瘤坏死因子α (TNFα)和白细胞介素-1β (IL-1β)存在的情况下，FLS中DNMT1和DNMT3a的表达水平下调，这可能导致这些细胞DNA甲基化的异常模式[12］．然而，关于DNA去甲基化与RA的发生和发展之间的联系的信息很少。因此，本研究旨在确定DNA去甲基化是否与RA的慢性相关，我们专注于TET酶作为DNA去甲基化的活性促进剂的作用。

详细资料和方法见补充资料(补充资料S1)．

TET3在RA患者滑膜和FLS中的表达

为了了解TET家族蛋白在RA进展中的作用，我们首先分析了RA患者滑膜中TET1/2/3蛋白、5mC和5hmC的表达谱，并将其与骨关节炎(OA)患者的表达谱进行了比较。免疫组化分析证实了TET2, TET3和5hmC在RA和OA滑膜中的表达。在TET蛋白中，TET3在RA患者中表达最高(图。1A)。此外，定量分析显示，与OA患者相比，RA患者中TET3和5hmC的表达水平都更高，而两组患者中TET2的表达水平相似(图1)。1B)。

接下来，我们尝试识别滑膜组织中表达TET蛋白的细胞类型。FLS (CD55)和单核/巨噬细胞(CD68)的细胞类型标记物被发现与TET2和TET3共定位，而TET1在这两种细胞类型中的表达水平都很低(图。1C). TET3在滑膜浅层高表达，并与CD55明显共染，但与CD68不共染(图。1C).相反，TET2和CD68的共染结果为共染，而CD55和TET2的共染结果为阴性(图5)。1C).由于在FLS中可以看到TET3在滑膜中的表达，我们继续评估了RA患者FLS原代培养中TET3的表达。培养的FLS免疫组化分析显示，TET3的表达水平高于TET1和TET2(数据未显示)。RA FLS表现为升高TET3与OA患者的FLS相比的表达(图。1F)。总的来说，这些发现表明FLS中的RA激活与TET3蛋白的表达相关，而与其他TET蛋白无关。

促炎细胞因子诱导TET3在FLS样品中表达

由于TET3在RA患者的FLS样本中高度表达，我们推断相关的促炎细胞因子可能起作用TET3诱导物。用促炎细胞因子处理培养的RA FLS，然后TET1/2/3在mRNA水平上评估表达。在春节成员中,只有TET3对TNFα、IL-1和IL-17的反应均有显著的诱导作用(图。2A).相比之下，没有增加TET1或TET2记录本试验中使用的9种细胞因子中的任何一种的表达。

TNFα诱导TET3的表达和甲基化DNA的羟化

然后我们测试促炎细胞因子是否在假定的DNA去甲基化过程中增强TET3功能。考虑到在RA进展过程中TNFα增加的临床影响，我们选择TNFα作为最有可能诱导应答的药物(图。2A).首先，我们在蛋白质水平上研究了TNFα对TET3调控的影响。Western blot证实TNFα在蛋白水平上增加了TET3的表达，这进一步得到了ImageJ软件定量图像分析的支持(图1)。2B).此外，获得的结果表明TNFα在转录水平诱导了这种反应，因为在TET3mRNA周转(补充图S1)．这些结果与培养的RA FLS在tnf - α刺激后48小时内TET3蛋白的显著积累一致(图。2C)。这种增加还伴随着5hmC的增加(图。2D)，提示RA进展过程中促炎细胞因子的增加刺激TET3的表达，导致RA FLS中甲基化DNA的羟基化。

TET3和TNFα调控的基因均与RA相关

据报道，持续暴露于促炎细胞因子可将FLS转化为产生多种关节炎分子的细胞[14］．然后我们继续使用基因微阵列分析(21448个基因)来描述培养的RA FLS的全局基因调控(n= 3)在存在或不存在抗TET3小干扰RNA (siRNA)[即，TET3- knockdown (KD)]，以确定TET3是否介导这种TNFα诱导的转化。的KD效率TET3通过qPCR和Western blotting(补充图S2A和B)。基因表达阵列分析采用四组[对照组siRNA (siCTL)/ tnf - α(-)， siCTL/ tnf - α(+)，TET3kd (siTET3) /肿瘤坏死因子α(-),或siTET3/TNFα(+)]，表达差异显著的基因(方差分析f检验，P< 0.05)用于分级分析(补充图S3.)．当我们比较siCTL/TNFα(+)组和siCTL/TNFα(-)组时，TNFα刺激在截止点[|log fold change (FC)| >0.58，错误发现率(FDR)校正f检验，P< 0.3)]如图所示。3.A，分别有280个上调基因和185个下调基因。当我们比较siTET3/TNFα(+)和siCTL/TNFα(+)组，受影响的基因数量TET3TNFα处理下-KD为180，上调基因93个，下调基因87个。据估计，有95个基因可能同时受TNFα和TET3，其中52个表达上调，43个表达下调。3.A、补充表1和S2)．这52个上调的基因编码了与RA进展相关的几个因子，包括那些与中性粒细胞迁移相关的因子[如C-X-C基序趋化因子配体8 (CXCL8),CXCL5]、细胞迁移[如心肌蛋白(MYOCD)、Calponin 1 (CNN1)和整合素亚基Beta 3 (ITGB3)]，放大炎症[例如白血病抑制因子(生活)及白细胞介素1 β (IL1B)]，原癌基因[KIT原癌基因，受体酪氨酸激酶(工具包原癌基因，核因子κB亚基(NF-κB)RELB)]，干扰素(IFN)诱导基因[干扰素诱导蛋白44样(IFI44L2 ' -5 ' -寡聚腺苷酸合成酶1 (OAS1)和含有2的自由基s -腺苷蛋氨酸结构域(RSAD2)]。那些已知会增加类风湿关节炎风险的变异基因也列在图中[TNF - α诱导蛋白3 (TNFAIP3)和脂肪酸去饱和酶2 (FADS2)]。

接下来，我们对这些基因进行了功能本体论和KEGG通路分析(图5)。3.B、补充表3.和S4)，并证实了预期的“TNF信号通路”的富集[16.1倍(P= 2.79e−06,FDR = 0.003)]。在与RA进展相关的已知信号通路中检测到显著的丰富，包括“nod样受体信号通路”、“NF-kappa B信号通路”、“细胞因子-细胞因子受体相互作用”和“趋化因子信号通路”(图4)。3.B)。由于cxc趋化因子是众所周知的RA进展的促进因子，我们继续进行了聚类分析，并显示几个C-C基序趋化因子可能受到TET3和TNFα的调控(图1)。3.C)。

TET3促进活化的FLS的迁移

为了验证这些因子对候选趋化因子的基因调控作用，利用培养的RA FLS进行实时定量pcr，以评估RA FLS的mRNA表达水平CXCL8，CCL2，核因子kappa-B配体受体激活剂(RANKL), osteoprotegerin (功能)、基质金属蛋白酶1 (MMP1),MMP13(无花果。3.D)RANKL，MMP1,MMP13(上调)以及功能(下调)被证明是tnf α依赖的，它们似乎是TET3独立的(图。3.D).众所周知，TNFα可诱导炎症介质的产生[5]，在RA FLS培养过程中其他介质的产生也评估了TET3的依赖性(图。3.E).虽然IL-1、IL-17A和TNFα在本研究中低于检测水平，可能是由于培养基的检出限，但TNFα诱导CXCL8和CCL2均被证实与TET3表达相关(图1)。3.E).观察到IL-6和VEGF对TNFα的反应增加，但显示与TET3无关(图。3.E). RA进展最显著的特征之一是在促炎细胞因子持续刺激下激活的FLS的细胞迁移和侵袭[5］．鉴于此，我们随后研究TET3是否确实参与了使用培养的RA FLS进行TNFα刺激后增加FLS的细胞流动性。划痕试验用于评估细胞迁移和侵袭[15),而TET3-KD消除了TNFα刺激对FLS细胞迁移的影响(图。3.F)。因此，TET3似乎介导了一组TNFα靶基因的作用，这些基因在进展中的RA关节中负责组织翳的形成。

Haploinsufficiency的TET3（TET3^{+ /−})可减轻K/BxN血清诱导的RA小鼠模型的RA进展

根据临床样本和培养的FLS的研究结果，我们假设FLS中TET3的表达促进关节RA的进展。为了进一步阐明这一点，我们试图说明TET3在RA小鼠模型的完整关节中的功能。在K/BxN血清治疗小鼠后，实现了典型的ra样表型的发展[16(图。4)，并使用TET3基因缺失的CL57BL/6系，因为在正常繁殖能力的小鼠中未观察到明显异常TET3haploinsufficiency [17，18］．野生型小鼠关节滑膜组织中TET2/3和甲基化dna染色明显。K/BxN血清转移可上调TET2、TET3和5hmC的表达水平(图。4A)，与人类RA临床样本的结果一致(图。1)．在TET3^{+ /−}K/BxN血清转移无法诱导TET3的显著表达，也不影响TET2的表达水平(图。4A).在WT和BxN血清转移后诱导急性关节炎TET3^{+ /−}老鼠(图。4B, C)。然而，关节炎的进展明显中止TET3^{+ /−}(图- k / BxN老鼠。4B).组织学分析表明TET3单倍体功能不足减弱关节炎进展的特征，包括减少滑膜炎症和骨破坏后的FLS增殖(图。4C).在患关节炎的WT-K/BxN小鼠中有明显的骨侵蚀，而在患关节炎的WT-K/BxN小鼠中没有TET3^{+ /−}-K/BxN小鼠的微计算机断层扫描(Fig。4D)。此外，K/BxN血清转移可有效诱导抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)阳性成熟破骨细胞在炎症滑膜与骨交界处的扩散，但这种作用在炎症滑膜与骨交界区不明显TET3^{+ /−}(图- k / BxN老鼠。4E).相反，与转染sirna的FLS相比，转染TET3沉默的FLS显著抑制了FLS的细胞增殖控制siRNA(补充图S4)．这些发现支持TET3功能在促进关节炎进展和水肿形成中的体内意义。

在此，我们评估了TET蛋白作为促进DNA去甲基化的主要酶在人类RA组织和RA小鼠模型中RA进展中的作用，以期评估表观遗传调控可能如何促进RA进展。在这些实验中，我们评估了所有三种TET蛋白的表达和甲基化DNA的超羟基化(5hmc)，我们的结果显示，在RA患者的滑膜组织中，TET3和5hmc显著增加(图。1A).免疫组化分析和RA滑膜FLS细胞培养的结合清楚地表明，这些FLS中TET3的表达增加(图。1C, D)。这些发现与之前关于表观遗传标记改变的报道一致，如DNA甲基化[12和组蛋白修饰[19，20.在RA患者的FLS中。此外，对临床样本的评估显示，在RA进展过程中产生的促炎细胞因子(TNFα， IL-1和IL-17)的增加明显诱导了TET3在培养的FLS中，无其他TETs表达。2A). TET1在RA滑膜组织中的表达水平低于TET3(图。1A)，在RA和OA患者中进行半定量比较(图。1B).此外，考虑到TET1与CD55/CD68之间没有重叠染色(图5)。1C)，我们可以假设TET1可能在关节中参与软骨形成[21］．在RA组织中，TET2在单核/巨噬细胞(CD68)中强表达，但在FLS (CD55)中不表达(图5)。1C)或培养的FLS(图。1D)。然而，其表达在RA和OA患者之间的差异可以忽略不计(图。1B).考虑到巨噬细胞在促炎反应中的全球作用和细胞分布，TET2可能修改RA滑膜组织中居住巨噬细胞的表观遗传事件[22］．为了验证TET3在完整动物RA进展中的作用，我们使用K/BxN血清转移诱导的RA小鼠模型[16]，观察到ra样关节炎的预期进展(图。4A).关节炎开始发作，但其进展明显中止于TET3haploinsufficiency [17，18)。4B, C)。此外，观察到较少的骨破坏TET3^{+ /−}(图- k / BxN老鼠。4D).考虑到FLS在RA进展中的关键作用，我们推测TET3促进了FLS和邻近细胞在RA进展中的炎症反应，可能是通过启动DNA去甲基化的表观遗传修饰。值得注意的是，TET3可以作为RA进展中的炎症指标，因为文献中没有其他合适的炎症FLS标记物。

考虑到TET3在RA滑膜中的表达上调(图。1A, C)，我们毫不惊讶地发现表达水平TET3发现在培养的FLS中，对与RA进展相关的几种促炎细胞因子的响应明显上调[2(图。2此外，我们还发现TNFα在培养的FLS中处理96 h也能有效上调TET3蛋白和5hmC的水平(图1)。2B, D).表达上调的分子基础TET3但可能与FLS中与这些细胞因子相关的细胞自主反应有关。这提示未来的研究应该集中在促进细胞因子介导的调控的分子机制上TET3表达式。这一调控机制是由基因表达分析所支持的TET3kd(无花果。3.A)，证明TET3促进tnf α介导的其他与RA进展相关的炎症因子的诱导。因此，我们推测在RA进展过程中产生的炎症因子的作用，至少在一定程度上促进了tet3介导的DNA去甲基化。

我们寻找可能与RA进展有关的TET3下游靶基因，并成功发现tnf α介导的52个下游基因的诱导需要TET3，其中包括炎症因子和cxc趋化因子等CCL2，CXCL5,CXCL8(无花果。3.a - c)。CXCL5而且CXCL8是强大的中性粒细胞招募者，而CCL2激活单核细胞和外周辅助T (Tph)细胞迁移能力[23]，以及单核细胞成熟为成熟的破骨细胞[24］．TET3在激活细胞迁移中的作用(图。3.F)和破骨细胞形成(图。4D, E)用TNFα进行实验验证。此外，已知这些趋化因子可增强RA进展过程中FLS的增殖和血管生成特性[25］．与这些趋化因子一样，在基因筛选中发现的白细胞介素(IL-1β和LIF)已被证明在RA进展过程中促进炎症[26，27］．IL-1β维持类风湿关节炎滑膜中的持续炎症，从而促进骨破坏，TNFα在类风湿关节炎滑膜中的诱导作用有充分的文献记载[26］．在RA滑膜中，TNFα诱导LIF可能通过转录激活因子4 (STAT4)的LIF信号通路和NF-κB和C/EBPβ的TNFα信号通路诱导IL-6 [28，29］．受体酪氨酸激酶c-kit的上调工具包)，在FLS中可能有助于增加RA进展过程中其配体干细胞因子(SCF)的存在的细胞流动性。

体内和体外观察清楚地表明TET3促进C-C基序趋化因子的基因诱导(CCL2而且CXCL8)，以及其他促炎细胞因子。然而，基因调控和DNA去甲基化之间相互作用的详细分子机制仍然未知[30.］．然而，当结合我们之前关于RA FLS DNA甲基化模式改变的发现[8]，我们可以假设，在DNA阵列中注意到的变化至少部分是由于RA进展过程中FLS中的DNA去甲基化事件。的感应CCL2而且CXCL8似乎是通过tet3介导的DNA去甲基化激活的基因启动子的增强来实现的。鉴于人们普遍认为被动的DNA去甲基化发生在DNA复制过程中，与TNFα和DNA去甲基化相关的基因表达变化可能也部分通过RA FLS DNA复制的增加介导。这一观点与RA进展过程中细胞增殖是由促炎细胞因子而非TNFα促进的事实并不矛盾。

总之，我们的研究结果表明，TET3在ra介导的关节破坏的进展和慢性过程中，都充当了不归点的表观遗传看门人。早期和有效的治疗干预，以防止这一进展到不可逆转的点可能是找到治疗恶化的风湿性关节炎的关键。结合我们的观察，很明显，我们的数据表明TET3可能是一个有前途的治疗干预靶点。

本研究中使用和/或分析的数据可根据合理要求从通讯作者处获得。

类风湿性关节炎:

类风湿性关节炎

读者:

呈synoviocytes

TET1/2/3:

一千零一十一年易位1/2/3

WT:

野生型

TET3^{+ /−}：

TET3heterozygous-deficient

5 hmc:

5-hydroxymethylcytosine

肿瘤坏死因子α:

肿瘤坏死因子α

CXCL:

C-X-C基序趋化因子配体

创新领导力:

C-C基序趋化因子配体

DNMTs:

DNA甲基转移酶

主持人:5

5-methylcytosine

5 hmc:

5-hydroxymethylcytosine

5 fc:

5-formylcytosine

5 cac:

5-carboxylcytosine

IL:

白介素

核:

小干扰RNA

KD:

可拆卸的

RANKL:

核因子kappa-B配体受体激活剂

功能:

Osteoprotegerin

MMP的:

基质金属蛋白酶

报告的作者们感谢博士们。Diane Mathis和Christophe Benoist(哈佛医学院)博士提供K/BxN小鼠。提供滑膜组织样本的Ken Sabanai和Yukichi Zenke(日本职业与环境卫生大学医学院骨科)，以及优秀技术助理Megumi Hirahara和Kahoru Noda。Gary S. Firestein教授(加州大学圣地亚哥分校)提供了富有见地的意见和建议。该研究项目部分由日本厚生劳动省、日本教育、文化、体育、科学技术省、UOEH促进职业健康研究补助金、三菱田边、MSD和卫材公司支持。

本研究项目部分由日本厚生劳动省、日本教育、文化、体育、科学技术省(17K09992)、勃林格- Ingelheim (RS2020A000673916)、卫材(HHCS20200929029)和三菱-田abe提供的科学研究援助研究补助金支持。

作者和联系

1. 日本职业与环境卫生大学医学院内科第一学系，日本北九州八桥西市石冈1-1,807-8555

   川边昭夫，山形薰，中野和久，坂田圭，中山田慎吾和田中吉也

2. 日本福岛磐城，chuoai -iino 5-5-1, 970-8551

   Shigeaki加藤

3. 日本福岛磐城市神野台57号，德和基金会创新医学研究所，972-8322

   Shigeaki加藤

4. 日本横滨aooba Kamoshida 1000，日本田边制药株式会社，药理学研究实验室1

   祺坂田

5. 九州大学AMORI前沿研究中心高级生物信息研究部，日本福冈西西元图卡744号，819-0395

   Yu-ichi Tsukada

6. 京都大学医学研究生院风湿病和临床免疫学系，日本京都佐代市Shogoin-kawara 54号，606-8507

   Koichiro Ohmura

贡献

A.K, K.N, K.S, K.Y, S.N, S.K, Y.T.设计了方法和实验，分析了数据，并解释了结果。a.k.， k.n.， k.s.和K.Y.进行了实验室实验。Y.T.准备TET3^{+ /−}老鼠。K.O.制备K/BxN血清。a.k.， k.n.， s.k.和Y.T.撰写了手稿。所有作者都参与、阅读并批准了最终稿件。

相应的作者

对应到Yoshiya田中．

伦理批准和同意参与

该研究方案由日本职业与环境卫生大学伦理审查委员会批准，并在样本收集时获得所有参与者的书面知情同意(H24-30)。所有动物实验均由日本职业与环境卫生大学动物护理与实验伦理委员会根据《动物护理实验原则指导》(AE 14-025)批准。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

三菱田边制药公司以工资的形式为坂田勋提供了支持。K. Nakano接受了来自安斯泰来、UCB、三菱田边和卫材的演讲费，并获得了来自三菱田边、卫材和礼来的研究资助。K. Ohmura曾获得Abbvie, Actelion, Astellas, Ayumi, Asahikasei-Pharma, Bristol-Myers, Eisai, Eli Lilly, GSK, Janssen, Mitsubishi Tanabe, Novartis, Sanofi的演讲费和/或酬金，并获得Bristol-Myers, Eisai, Eli Lilly, GSK, Mitsubishi Tanabe, Nippon-Kayaku的研究资助。S. Nakayamada获得了百时美施贵宝、赛诺菲、艾伯维、卫材、Chugai、辉瑞、武田、旭kasei的演讲费，并获得了三菱田部、诺华和默沙东的研究资助。Y. Tanaka曾从Daiichi-Sankyo, Astellas, Chugai, Eli Lilly, Pfizer, Abbvie, YL Biologics, Bristol-Myers, Takeda, Mitsubishi-Tanabe, Novartis, Eisai, Janssen, Teijin获得演讲费和/或酬金，并从朝日kasei, Mitsubishi-Tanabe, Chugai, Takeda，赛诺菲，Bristol-Myers, UCB, Daiichi-Sankyo, Eisai和Ono获得研究资助。所有其他作者声明无利益冲突。

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