在细胞与免疫细胞相互作用过程中，滑膜细胞和皮肤成纤维细胞对IL-23产生和IL-23受体表达的影响相反

背景

IL-23/IL-17轴参与炎症性疾病，包括关节炎和银屑病。然而，对IL-23或IL-17抑制剂的反应因疾病而异。目的是比较免疫细胞和基质细胞之间相互作用对IL-23轴的影响，以了解这些差异。

方法

外周血单个核细胞与RA滑膜细胞或Pso皮肤成纤维细胞共培养，加入或不加入植物血凝素、IL-23或抗IL-23抗体。ELISA法测定IL-6、IL-1β、IL-23、IL-17、IL-12和IFNγ的含量。采用RT-qPCR方法分析IL-23和细胞因子受体基因(IL-17RA、IL-17RC、IL-12Rβ1、IL-12Rβ2和IL-23R)的表达。流式细胞术检测IL-12Rβ1和IL-23R亚基。

结果

滑膜细胞或皮肤成纤维细胞产生的IL-6、IL-1β、IL-17、IL-12和IFNγ非常相似，细胞与免疫细胞的相互作用增加了它们的产生，特别是IL-17。观察到IL-23的主要差异。与滑膜细胞而非皮肤成纤维细胞的相互作用降低了IL-23的分泌，而mRNA水平增加，主要与滑膜细胞相互作用，反映出主要的消耗差异。IL-23的添加只有一个作用，即IL-17的分泌增加。在与滑膜细胞或皮肤成纤维细胞共培养时，细胞活化对细胞因子受体基因表达产生了类似的影响。关键的区别是取决于基质细胞来源的细胞相互作用效应。与滑膜细胞的相互作用增加了IL-23受体亚基的mRNA水平和IL-23R的表面表达水平，而与皮肤成纤维细胞的相互作用降低了其mRNA水平的表达，在表面表达水平上没有影响。

结论

免疫细胞和基质细胞之间的相互作用对细胞因子的产生及其受体的表达至关重要。基质细胞的来源对IL-23的产生及其受体的表达有重要影响。这种差异可以部分解释治疗反应的异质性。

在慢性炎症中，如炎症性关节炎或银屑病(Pso)，免疫细胞迁移到炎症部位，导致局部与基质细胞、滑膜细胞和皮肤成纤维细胞相互作用。这种免疫浸润包括Th17细胞和其他产生il -17的T细胞[1，2，3.，4］．它们的积累见于银屑病皮损[5类风湿性关节炎(RA)、强直性脊柱炎(AS)和银屑病关节炎(PsA)的滑膜组织中[6］．

IL-23是Th17表型背后的关键驱动力[7通过放大和稳定Th17细胞增殖，促进致病性和IL-17分泌。IL-17通过多种细胞类型，包括滑膜细胞和皮肤成纤维细胞，刺激促炎性细胞因子的产生[8］．尽管IL-23/IL-17轴明显共同参与，但对IL-23或IL-17抑制剂的反应因疾病而异。最明显的区别是IL-17和IL-23抑制在Pso中效果显著，而在PsA中效果较低，而只有IL-17抑制在AS中起作用，在RA中有一定的阴性结果[9，10］．在本研究中，我们从两个极端中选择了与疾病位点相关的基质细胞:Pso和RA。

基质细胞位于不同的解剖部位，形成不同的临床分布，RA和PsA为关节，Pso为皮肤。通过体外共培养模型，我们发现与滑膜或皮肤基质细胞的相互作用对放大促炎细胞因子的产生至关重要，对IL-17有重要影响[11，12］．

尽管有一些相似之处，但也观察到不同之处，例如单核细胞在与皮肤成纤维细胞的相互作用中起作用，但与滑膜细胞没有相互作用[11，12］．基质细胞在特定器官中表现出强烈的异质性、器官依赖性和位置依赖性，这在类风湿关节炎滑膜细胞中有很好的描述[13］．滑膜细胞亚群已被确认具有解剖上离散的、功能上不重叠的炎症作用[14］．这种异质性可能会影响与免疫细胞相互作用的结果，并对理解治疗反应具有重要意义。

本研究的目的是比较免疫细胞和不同基质细胞之间相互作用对IL-23的影响。我们选择RA滑膜细胞和Pso皮肤成纤维细胞，因为这些细胞来自两种疾病，对IL-17/IL-23通路的抑制产生完全相反的反应。利用滑膜细胞或皮肤成纤维细胞和外周血单个核细胞(PBMCs)之间的共培养系统，我们分析了细胞相互作用对细胞因子产生和受体基因表达的影响，重点是IL-23。

样品

滑膜细胞来自接受关节手术的RA患者的滑膜组织[15］．皮肤成纤维细胞来自符合银屑病分类标准的银屑病患者的皮肤活检[12］．滑膜和皮肤活检按所述处理[11，12］．滑膜细胞和皮肤成纤维细胞在第4至第9代之间使用。来自健康捐献者的pbmc通过Ficoll-Hypaque (Eurobio, Courtaboeuf, France)离心分离。所有患者都签署了知情同意书。该方案由里昂医院伦理委员会批准，编号为AC-2016-272。

共培养试验

将基质细胞接种一夜，第二天，按5:1的比例添加pbmc，添加或不添加植物血凝素(PHA, 5 μg/ml)，如所述[11，12］．将IL-23 (50 ng/ml)、抗IL-23抗体(1μg/ml) (R&D Systems, Minneapolis, USA)或对照无关抗体(1μg/ml) (Dendritics, Lyon, France)添加到细胞培养中，细胞单独或共培养。48 h后，收集上清进行分析，细胞进行CD3、CD4、CD69和CD86染色。

为了获得mRNA的表达，共培养开始时，将滑膜细胞或皮肤成纤维细胞在12孔板中以15 × 10的密度播种一夜⁴细胞/孔在完整的RPMI 1640培养基(Eurobio, Courtaboeuf, France, RPMI培养基中添加10%胎牛血清(FBS)， 2 mMl-谷氨酰胺，100U/ml青霉素/链霉素)。第二天，PBMCs (75 × 10⁴细胞/孔)在完整的RPMI培养基中接种，不含或含PHA (5 μg/ml)或IL-23 (50 ng/ml)。24小时后，回收细胞进行RNA提取。

流式细胞术

EFluor 450-CD3 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA, Invitrogen)、PE-Cy7-CD4 (Thermo Fisher Scientific, Invitrogen)、FITC-CD69 (Becton Dickinson (BD)， Franklin Lakes, NJ)、PE-CD86 (BD Biosciences)、pe - vio750 - cd45 (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany)、PE-IL-12Rβ1 (R&D Systems)和PerCP-IL-23 (R&D Systems)用于细胞表面染色。细胞在4℃的染色缓冲液(PBS 1× + 2%的FBS)中孵育20分钟，洗涤，流式细胞仪分析(Navios, Beckman Coulter，布雷亚，CA, USA)。使用FlowJo软件进行分析。

RNA提取和实时qPCR

使用RNeasy Mini Kit (Qiagen®，Hilden, GE)提取细胞总RNA，并使用Qubit检测(Invitrogen™，Carlsbad, CA, USA)进行量化。利用定量反转录试剂盒(Qiagen®)合成cDNA。基于SYBR绿色的实时qrt -PCR在CFX96实时PCR检测系统(BioRad, Hercules, CA, USA)上使用QuantiFast SYBR绿色试剂盒进行。周期阈值以GAPDH归一化。采用比较阈值循环法测定IL-17RA、IL-17RC、IL-23R、IL-12Rβ1、IL-12β2和IL-23基因的相对表达量。IL-23R、IL-12Rβ1和IL-12Rβ2引物的设计如前所述[13(Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA)。GAPDH、IL-17RA、IL-17RC和IL-23是定量引物(QT01192646、QT00022414、QT00022498、QT00204078，分别为Qiagen®)。

酶联免疫吸附试验(ELISA)

IL-17A、IL-6、IL-1β、IL-12 (Diaclone, Besançon, France)、IL-23和ifn - γ (R&D系统)产物用商用ELISA试剂盒从培养上清中进行评估。

统计分析

采用配对非参数Wilcoxon或Mann-Whitney检验进行统计分析。所有分析均使用GraphPad Prism 6软件进行。p小于0.05的值被认为是显著的。

与滑膜细胞相互作用对Th17/Th1细胞因子产生的影响

基质细胞(如滑膜细胞或皮肤成纤维细胞)与免疫细胞之间的物理相互作用对于诱导关节炎或银屑病皮肤炎症部位产生细胞因子至关重要[11，12］．transwell系统的使用，防止细胞与细胞的直接接触，但允许可溶性因子的交换，证实了这一作用，因为在没有物理相互作用的情况下，细胞因子的产量显著下降[11，12］．在这里，我们使用基质细胞、RA滑膜细胞或Pso皮肤成纤维细胞和免疫细胞之间的共培养系统来评估Th1和Th17细胞因子的产生，特别是对IL-23的兴趣。选择RA和Pso基质细胞，因为这些细胞来自对IL-17/IL-23抑制反应不同的两种疾病。

与单独细胞相比，与RA滑膜细胞相互作用可诱导独立于细胞激活的高IL-6产生(p =0.016,无花果。1A).细胞相互作用和激活都增加了IL-1β的分泌，与单独对照和PHA条件下的PBMCs相比，共培养中IL-1β的分泌增加了约两倍(p = 0。016年,无花果。1一个)。

我们接下来关注的是Th17途径的细胞因子IL-23和IL-17，以及Th1途径的细胞因子IL-12和IFNγ。在对照组、PBMCs和共培养条件下几乎检测不到IL-17的产生。1A). PHA增加IL-17的分泌(p =0.016,无花果。1A)，但与单独PBMCs相比，共培养时其浓度要高得多(229.7±57.9 vs. 89.7±21.5 pg/ml;p =0.016,无花果。1一个)。

对于IL-23，细胞相互作用使其产量减少约两倍于单独PBMCs (p= 0.016,无花果。1A)。此外，与对照相比，PHA增强了共培养中IL-23的下降(104.8±19.0 vs. 179.5±30.6 pg/ml;p= 0.016;无花果。1A). IL-23分泌的减少可能是由于IL-23的消耗导致了IL-17的产生，这解释了共培养中IL-17的更高产量。

IL-12的结果与IL-23相反，细胞相互作用增加。而IL-17在活化共培养条件下产量最高(p= 0.016;无花果。1一个)。

ifn - γ的结果与IL-17相似。在对照组中，即使细胞相互作用增加了ifn - γ的分泌，ifn - γ的分泌也很低。p= 0.016;无花果。1A). PHA强烈增加ifn - γ的分泌，但与单独PBMCs相比，共培养中的ifn - γ水平甚至更高(1034.3±206.5 vs. 244.6±93.8 pg/ml;p =0.016,无花果。1一个)。

总结这部分关于滑膜细胞的内容，细胞间的相互作用足以诱导IL-6和IL-1β的产生，而IL-17、IL-12和ifn - γ的大量分泌需要细胞激活和相互作用。与所有其他细胞因子相比，IL-23的产生通过与滑膜细胞的相互作用而减少。

与皮肤成纤维细胞相互作用对Th17/Th1细胞因子产生的影响

为了比较关节和皮肤疾病，我们观察了PBMCs和皮肤成纤维细胞之间的相互作用对Th17/Th1细胞因子产生的影响。皮肤成纤维细胞来自于同一Pso皮肤区域的两个活组织切片，一个来自非皮损(NLSF)皮肤，一个来自皮损(LSF)皮肤。

IL-6, IL-1β， IL-17, IL-12和ifn - γ的产生与滑膜细胞获得的相似(图。1B).与NLSF或LSF相互作用诱导独立于细胞激活的高IL-6产生(p= 0.016,无花果。1B).细胞相互作用和PHA都增加了IL-1β的分泌(p= 0.016;无花果。1B).对照条件下的IL-17浓度几乎检测不到(图。1B). PHA增加了pbmc和共培养中IL-17的产生(p= 0.016;无花果。1B)，但在活化共培养物中观察到的浓度最高(p= 0.016;无花果。1B).细胞相互作用增加IL-12的分泌，主要与PHA (p= 0.016,无花果。1B).细胞活化和相互作用足以诱导IFNγ的产生，其浓度在活化共培养物中最高(p= 0.016;无花果。1B)。还应注意的是，LSF产生的IFNγ高于NLSF (p= 0.016;无花果。1B)。

IL-23的结果与滑膜细胞不同，滑膜细胞中IL-23的产生减少(图。1A).在对照组或PHA条件下，皮肤成纤维细胞(无论是NLSF还是LSF)没有观察到这种下降(图1)。1B).为了更好地理解这种差异，我们观察了IL-23 mRNA的表达(图2)。2)．首先，不出所料，仅在细胞中，IL-23 mRNA主要在PBMC中检测到(图1)。2A)和PHA轻微降低IL-23 mRNA(图。2A)与IL-23产生的影响相关(图。1)．为了观察细胞相互作用对IL-23 mRNA的影响，将单独培养的PBMCs和滑膜细胞或PBMCs和皮肤成纤维细胞聚集在一起，然后从联合细胞亚群中回收RNA，与共培养中回收的RNA进行比较(图1)。2B).此外，为了更好地比较不同的细胞类型，将单独培养和聚集培养的细胞的表达归一化为1，并相应地对共培养的细胞表达进行合理化。细胞与滑膜细胞的相互作用显著增加了对照组和PHA中IL-23的表达(p= 0.03,无花果。2B). NLSF在对照组中，表达显著增加(p= 0.03,无花果。2B)， PHA中也是如此，但没有达到显著值(p= 0.06,无花果。2B).对于LSF，它只是一个增加的趋势，因为没有什么显著的。IL-23 mRNA的增加在滑膜细胞中最高。2B)，而IL-23的产生在与滑膜细胞相互作用时显著降低，但与皮肤成纤维细胞没有相互作用(图。1)．与皮肤成纤维细胞相比，这可能涉及与滑膜细胞共培养时IL-23的消耗更高。

总结这部分关于皮肤成纤维细胞的内容，大多数细胞因子的结果与滑膜细胞的结果非常相似，在滑膜细胞中，相互作用诱导促炎细胞因子，主要由细胞激活引起。平均而言，LSF比NLSF更有效。然而，观察到IL-23的主要差异。细胞与RA滑膜细胞的相互作用减少了IL-23的分泌，而与Pso皮肤成纤维细胞的相互作用增加了IL-23 mRNA的表达。这可能反映了不同基质细胞来源的共培养过程中IL-23的不同消耗。

细胞与不同来源基质细胞相互作用对细胞活化的影响

为了进一步研究基质细胞在PBMC激活中的作用，我们通过流式细胞术观察了激活标志物(CD69和CD86)的表达。用CD3和CD4标记来区分不同的PBMC亚群。

首先，我们观察到PHA和细胞相互作用对CD3+细胞的百分比都没有影响(图1)。3.A). PHA激活细胞显著降低PBMCs中CD3+CD4+细胞的百分比(p= 0.05,无花果。3.A)，并在共培养中有减少的趋势(图。3.A).此外，细胞相互作用也降低了CD3+CD4+细胞的百分比，独立于基质细胞来源，与单独PBMCs相比(p= 0.05,无花果。3.一个)。

然后，我们观察了CD69和CD86激活标记。在CD3+细胞中，PHA显著增加两个激活标记(p= 0.05,无花果。3.B)没有细胞相互作用的附加效应(图。3.B).在CD3−细胞中，PHA没有明显作用，而细胞相互作用倾向于增加CD69和较低程度的CD86(图5)。3.有趣的是，如果细胞相互作用对CD69+和CD86+细胞的百分比没有明显影响，它们似乎增加了荧光强度(MFI)的测量，主要是CD86(图1)。3.C).在CD3+细胞中，我们已经区分了CD4+细胞和CD4−细胞(图4)。3.D).在CD4+细胞中，PHA显著增加CD69和CD86标记物(p= 0.05,无花果。3.D)，并通过细胞相互作用加强(图。3.D).在CD4−细胞中，只有PHA有作用，在pbmc中达到显著值(p= 0.05,无花果。3.D).滑膜细胞和皮肤成纤维细胞的结果是一样的。

综上所述，PHA主要激活CD3+细胞，因此淋巴细胞群和细胞相互作用主要增强了CD4+淋巴细胞的这种作用。CD3+CD4+激活的增加与需要PHA激活和细胞相互作用的高IL-17生成相关(图。1)．

IL-23促进Th17/Th1细胞因子的产生

基于滑膜细胞和皮肤成纤维细胞之间相互作用对IL-23产生的差异，以及抗IL-23治疗的临床结果，我们接下来关注IL-23参与细胞相互作用产生的细胞因子，通过在共培养中添加IL-23或阻断抗IL-23抗体。

对于滑膜细胞和皮肤成纤维细胞，与IL-23或抗IL-23抗体共培养的治疗对IL-6、IL-1β或IFNγ没有影响(图。4A).添加外源性IL-23后，培养物中的IL-23浓度约为50 ng/ml(数据未显示)，反映了添加的IL-23。抗IL-23抗体对IL-23的产生没有影响，除了一名滑膜细胞患者(对照组，92.2 pg/ml vs.抗IL-23, 836.6 pg/ml)，解释了大扫描电镜(图。4一个)。

与滑膜细胞和LSF共培养时，添加的IL-23具有功能性，因为IL-17的分泌增加了(p≤0.03)，NLSF较低(图。4A).相反，抗il -23抗体对与滑膜细胞或LSF共培养无影响，但降低了与NLSF共培养的IL-17 (p= 0.02,无花果。4A).抗il -23抗体的作用是特异性的，因为在第一次实验中使用了对照抗体，对细胞因子的产生没有影响(图1)。4B)。

关于IL-12, IL-23只通过增加IL-12的分泌对NLSF共培养产生影响(p= 0.03,无花果。4A)而抗il -23抗体没有效果(图。4一个)。

外源性IL-23或抗IL-23抗体的作用可能没有预期的那么明显。有趣的是，滑膜细胞和LSF的结果非常相似，但在IL-17和IL-12的产生方面与NLSF的结果不同。

IL-23和细胞活化对离体细胞细胞因子受体基因表达的影响

在确定了皮肤成纤维细胞和滑膜细胞之间关于IL-23途径的差异后，需要考虑的一个关键点是细胞因子受体表达的可能差异。对细胞因子的反应由膜受体介导，通常由两个链组成:IL-17RA/IL-17RC用于IL-17, IL-12β1/IL-12β2用于IL-12, IL-12β1/IL-23R用于IL-23。我们单独测量了PBMCs、滑膜细胞或皮肤成纤维细胞中的受体mRNA表达，并在对照、PHA激活和IL-23治疗三种条件下进行了测量。

在分离细胞中，除IL-17RC外，PBMCs中所有亚单位的表达值都高于滑膜细胞(图。5)、NLSF和LSF(图4。6)．仅在pbmc中，PHA降低IL-17RA (p= 0.03,无花果。5而且6，但IL-12Rβ2表达显著增加(p= 0.03,无花果。5而且6)．IL-12Rβ1和IL-23R表达轻度升高，但不显著。IL-23治疗仅显著增加IL-17RC表达(p= 0.03,无花果。5而且6)．

仅在基质细胞中，PHA和IL-23没有主要影响。5而且6)，除NLSF中IL-17RC表达显著增加外(p= 0.03,无花果。6)．在与滑膜细胞、NLSF和LSF共培养的三种细胞中，IL-23对受体基因表达没有影响，而PHA显著增加了IL-12Rβ2和IL-23R (p= 0.03,无花果。5而且6)．IL-12Rβ1在NLSF和LSF共培养时显著升高(p= 0.03,无花果。6)，但这只是滑膜细胞的一种倾向，没有任何意义(图。5)．

总之，与IL-23相比，在PBMCs和共培养物中，这些细胞因子受体基因的表达主要受PHA激活的调控。仅在基质细胞中，RA滑膜细胞或Pso皮肤成纤维细胞，受体基因表达似乎不受PHA或IL-23的调节。仅在PBMCs中，PHA降低了IL-17RA和IL-17RC的表达，而增加了IL-12Rβ1、IL-12Rβ2和IL-23R的表达。在共培养中，PHA与RA滑膜细胞和Pso皮肤成纤维细胞相似地调节受体基因表达，主要增加IL-23受体亚基的表达。

细胞相互作用对细胞因子受体基因表达的影响

由于细胞因子受体基因的表达和调控在滑膜细胞和皮肤成纤维细胞中是相似的，我们接下来关注的是细胞相互作用的影响。为了更严格地研究这一点，将PBMCs和基质细胞单独培养或与PHA共培养。在培养结束时，将单独培养的PBMCs和滑膜细胞或PBMCs和皮肤成纤维细胞聚集在一起，然后从联合细胞亚群中回收RNA。这允许从两种细胞类型中恢复RNA，我们可以将其与从共培养中恢复的RNA进行比较。使用该方案，我们可以观察到细胞相互作用对受体基因表达的直接影响(图。7)．

与滑膜细胞的相互作用不影响IL-17受体亚单位的表达，而相比之下，皮肤成纤维细胞(NLSF和LSF)降低了IL-17受体亚单位的表达(p= 0.03,无花果。7)．IL-12Rβ1、IL-12Rβ2和IL-23R表达在基质细胞之间的差异更加明显。与滑膜细胞相互作用增加IL-12Rβ1和IL-23R的表达(p≤0.03,无花果。7)，而那些有皮肤成纤维细胞的人则强烈减少NLSF (p= 0.03,无花果。7)，对LSF没有影响。IL-12Rβ2在滑膜细胞中的表达明显增加(p= 0.03,无花果。7)，而NLSF和LSF无显著影响。然而，在LSF中观察到轻微的增加。

为了证实IL-23受体调控的差异，我们用流式细胞术分析了其表达。IL-12Rβ1和IL-23R亚基在单独或共培养细胞中均可见。PBMCs和基质细胞由CD45来区分，PBMCs表达CD45(单独PBMCs中CD45+细胞的比例为93.6±6.22%，共培养PBMCs中CD45+细胞的比例为89.1±2.6%，数据未显示)，而基质细胞不表达CD45(阳性细胞的比例低于1%，数据未显示)。正如预期的mRNA结果，基质细胞不表达IL-23受体的亚单位(< 1%的阳性细胞，数据未显示)。在PBMCs中，IL-12Rβ1呈组成性表达，其表达不受细胞相互作用的影响(图。7B)。然而，IL-23R亚基在PBMCs中弱表达(1.6±0.3%的IL-23R+细胞，图。7B).与滑膜细胞相互作用使其表达显著增加(IL-23R+细胞的2.91±1.1%，p= 0.03,无花果。7B)，但NLSF(1.9±0.8%的IL-23R+细胞，图。7B).这些结果加强了在mRNA水平观察到的差异。此外，受体的表达是在培养24小时内完成的，观察之后的时间，看看这种差异是否会持续和增加，这将是有趣的。对于LSF，由于各种反应导致的较大标准偏差，结果更难以解释，包括一位患者将IL-23R+细胞的百分比增加到22.6%。然而，我们可以注意到的是，结果最终是在滑膜细胞和NLSF之间，至于mRNA，有增加IL-23R表达的趋势，但没有达到显著性。

综上所述，根据基质细胞来源的不同，细胞间的相互作用对受体基因表达的调控非常不同，甚至是相反的方向。简单地说，与滑膜细胞的相互作用增加了IL-23受体亚基在mRNA水平和IL-23R在表面表达水平的表达，而与非损伤性皮肤成纤维细胞的相互作用降低了它们在mRNA水平的表达，在表面表达水平上没有影响。LSF的情况介于NSLF和滑膜细胞之间。

IL-23/IL-17轴参与多种炎症性疾病，包括RA、PsA、AS和Pso等。尽管他们的理解可能被过分简化了，但临床现实显示，这种理解在某些领域过于有限，无法解释针对IL-23和IL-17的治疗反应的异质性[9，10］．

利用我们的工具和之前的结果，我们专注于不同来源的免疫细胞和间质细胞之间的相互作用对IL-17/IL-23途径的影响可能存在的差异，尤其对IL-23感兴趣。我们从两个极端中选择了与疾病位点相关的基质细胞:Pso vs. RA, Pso对IL-17/IL-23抑制敏感，RA对IL-17/IL-23抑制不敏感或不敏感。

细胞间相互作用足以诱导IL-6和IL-1β的分泌。它们也足够，但通过细胞激活IFNγ和IL-12的产生进一步增强。高水平的IL-17分泌需要细胞激活和相互作用。这些结果与来自关节和皮肤的基质细胞非常相似。主要的区别在于IL-23的生产。与滑膜细胞的相互作用降低了IL-23的产生。这与RA滑膜中发现的低水平生物活性IL-23是一致的[16］．相比之下，皮肤成纤维细胞中IL-23的产生并没有减少，这与银屑病斑块中生物活性IL-23的存在一致[17］．此外，我们还发现，在与RA滑膜细胞共培养时，mRNA大幅增加，而产量显著下降。加上受体表达增加，这一结果与IL-23早期高消耗相关，降低了IL-23的生物利用度。在Pso环境下，与PBMCs相比，共培养中IL-23 mRNA的增加程度较低，但产量几乎相似。加上受体表达减少，这一结果与IL-23消耗微弱但持续相关，保持一定的生物利用度。这反映了两种制度之间的一个重要区别。目标生物利用度可能与更好的反应相关联，这是有道理的[18］．我们的研究结果支持这一假设，与Pso中的皮肤成纤维细胞相比，滑膜细胞减少IL-23的产生，导致关节炎反应较低。最近一项比较配对皮肤和滑膜的PsA研究也支持这一概念，与PsA滑膜相比，病变皮肤中IL-23的表达更高[19］．最后，需要更多的研究来更好地比较RA滑膜细胞、PsA滑膜细胞、PsA皮肤成纤维细胞或Pso皮肤成纤维细胞。这将对基质细胞起源在IL-23生产中的重要性以及由此产生的IL-23生物利用度提供更全面的认识。

我们之前的结果已经发现了另一个不同，关于单核细胞对IL-17分泌的贡献。对于滑膜细胞，从PBMCs中消除单核细胞对IL-17的产生没有影响[11]，与尽管IL-23下降，但观察到的IL-17持续高产量一致。相反，在皮肤成纤维细胞中，去除单核细胞从而去除IL-23的主要来源会减少IL-17的产生。在这种情况下，单核细胞去除作用于级联反应，首先减少IL-23，然后减少IL-17的分泌[12］．这反映了IL-17产生机制的关键差异，取决于基质细胞来源。在某些情况下，IL-17的产生可以不依赖于il -23，正如RA和部分PsA所建议的那样[20.］．这些结果表明淋巴细胞和滑膜细胞之间的相互作用直接作用于IL-17的分泌，而不需要单核细胞，因此也不需要IL-23。相反，对于皮肤成纤维细胞，单核细胞确实有作用，至少部分是通过它们产生IL-23。这些不同的结果与Pso、PsA和AS之间IL-23/IL-17轴的潜在差异的假设一致，并可以部分解释对治疗的不同反应。

接下来，我们关注IL-23的贡献。令人惊讶的是，外源性IL-23或抗IL-23抗体的作用在某种程度上没有预期的那么明显。有趣的是，滑膜细胞和LSF的结果非常相似，但在IL-17和IL-12的产生方面与NLSF的结果不同。这一点强调基质细胞异质性是组织特异性和疾病特异性的。对类风湿关节炎滑膜细胞的病理变化进行了充分研究，研究表明，通过一种具有侵袭性和免疫刺激的表型，可以促进慢性关节炎的发生[13］．这些结果还有待扩大到其他解剖部位和疾病。

IL-23抑制的缺乏可能是由于动力学效应，IL-23在Th17分化早期起作用。在我们的实验中，我们在共培养中直接阻断了IL-23，而IL-23可能在细胞相互作用之前就起作用了，甚至可能在迁移之前。动力学实验可以更好地了解IL-23的作用部位。动力学也有助于理解Pso和RA在抗il -17作用上的差异。在风湿性关节炎中，IL-17已被证实在早期阶段起作用[21，22］．在早期风湿性关节炎中解决这一点的试验仍然缺乏。相反，在Pso中，病变斑块中IL-23和Th17细胞的永久存在导致IL-17的持续分泌和贡献。

为了解释上述差异，我们将重点放在IL-17/IL-23轴相关细胞的细胞因子受体基因表达上。有趣的结果来自于细胞相互作用的影响。我们已经证明，细胞相互作用产生的细胞因子在滑膜细胞和皮肤成纤维细胞之间是相似的，除了IL-23。受体基因表达调控更依赖于基质细胞来源。IL-17RA和IL-17RC的表达不受RA滑膜细胞相互作用的影响，但与Pso皮肤成纤维细胞的相互作用降低。IL-12Rβ1、IL-12Rβ2和IL-23R的调控更为复杂。滑膜细胞与NLSF中这三个亚单位的调节方式相反。它们在滑膜细胞中的表达增加，而在NLSF中表达减少。与基质细胞起源相关的异质性可以因此影响细胞因子受体的表达和细胞反应。此外，基质细胞亚群内的异质性可以产生不同的反应，如NLSF和LSF的差异。 IL-12Rβ1 expression was not affected by cell interactions with LSF while it was largely decreased with NLSF. In addition, IL-12Rβ2 expression was not affected or slightly decreased with NLSF, but rather slightly increased with LSF. IL-23R expression was also decreased with NLSF, but not with LSF. The difference between NLSF and LSF could come from the pathological state of cells. LSF came from lesional skin thus with an inflammatory state more important than NLSF which came from “healthy” skin. The results with LSF seemed to be between those with NLSF and those with RA synoviocytes. RA synoviocytes display an inflammatory state that could be closer to LSF than NLSF. The inflammatory state of stromal cells, independently of their origin, may influence the regulation of cytokine gene receptor expression. Furthermore, the expression at the cell surface of IL-23R also displayed a different regulation depending on stromal cell origin. While the IL-12Rβ1 subunit was constitutively expressed in PBMCs, mainly in lymphocytes, and not altered by cell interactions, IL-23R subunit was significantly increased by cell interactions with synoviocytes but not with NLSF. As for mRNA, the results for LSF were between synoviocytes and NLSF. As the cell surface expression of the receptors was done at the same time point as mRNA, it would be interesting to look at later times to see if this difference persists and increases, meaning an increase of IL-23R with synoviocytes and no effect or a decrease with NLSF. These results confirm the importance of stromal cell heterogeneity that appears at different levels, tissues, diseases, and pathological states. This heterogeneity has been highlighted in PsA, by comparing matched skin and synovial tissues [19］．这强调了在理解治疗反应时考虑基质细胞异质性的重要性。为了进一步证实和推广细胞因子受体表达的结果，还需要做更多的实验。transwell系统可用于确认细胞相互作用在基因表达调控中的关键作用。还应确定蛋白水平，将基因表达的研究扩展到细胞表面受体表达的更功能水平。这些初步结果使我们能够部分解释不同疾病对IL-17/IL-23抑制反应的差异。然而，为了更好地理解RA和Pso在IL-17/IL-23轴上观察到的差异所涉及的机制，这项研究需要继续进行。

综上所述，免疫细胞和基质细胞之间的相互作用是细胞因子产生的关键因素，也是它们受体表达的调节因素。这些结果提示基质细胞的起源和激活状态都影响细胞间相互作用的反应，甚至对IL-23的产生产生相反的作用，从而对IL-17轴产生不同的作用。对这种差异的理解至少可以部分解释IL-23和IL-17抑制剂反应的一些意想不到的差异，这取决于疾病和疾病特异性间质细胞亚群。

支持本稿件结论的数据集包括在稿件中。

为:

强直性脊柱炎

ELISA:

酶联免疫吸附试验

GAPDH:

Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶

干扰素γ:

干扰素γ

IL -:

白介素-

LSF:

Lesional皮肤成纤维细胞

NLSF:

Non-lesional皮肤成纤维细胞

PBMC:

外周血单个核细胞

PHA:

植物凝集素

PsA值:

银屑病关节炎

算法:

牛皮癣

类风湿性关节炎:

类风湿性关节炎

RNA:

核糖核酸

RPMI:

罗斯威尔公园纪念研究所

RT-qPCR:

实时定量逆转录聚合酶链反应

Th:

辅助T细胞

一个也没有。

这些研究部分得到了Société Française de Rhumatologie的资助。

作者和联系

1. 免疫基因组学和炎症研究部门，爱德华·赫里奥特医院，里昂民事临终关怀院和里昂大学，法国里昂，火苗广场，69003

   Mélissa Noack & Pierre Miossec

贡献

MN:概念、实验和写作。PM:概念，写作和最终稿。作者(们)阅读并批准了最终稿。

相应的作者

对应到皮埃尔Miossec．

伦理批准和同意参与

所有患者都签署了知情同意书。该方案由里昂医院伦理委员会批准，编号为AC-2016-272。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争利益。

出版商的注意

卡塔尔世界杯常规比赛时间施普林格自然对出版的地图和机构附属的管辖权要求保持中立。

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