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Dersimelagon,一种新的口服黑素皮质激素1受体激动剂,在系统性硬化症的临床前模型中显示了疾病改善作用
2022卡塔尔世界杯附加赛赛程体积24文章编号:210(2022)
摘要
背景
黑素皮质激素1受体(MC1R)的激活被认为具有广泛的抗炎和抗纤维化作用。本研究的目的是研究一种新型口服MC1R激动剂dersimelagon作为系统性硬化症(SSc)治疗药物的潜力。
方法
采用博莱霉素(BLM)诱导的SSc小鼠模型,研究了皮西甲素磷酸(MT-7117)对皮肤纤维化和肺炎症的影响。采用微阵列技术对blm诱导的SSc模型进行基因表达分析和血清蛋白分析。体外观察MT-7117对转化生长因子-β (TGF-β)诱导的人真皮成纤维细胞活化的影响。对SSc患者皮肤中MC1R的表达进行免疫组化分析。
结果
MT-7117(≥0.3 mg/kg/day p.o.)预防性治疗显著抑制blm诱导的SSc模型的皮肤纤维化和肺炎症,MT-7117(≥3 mg/kg/day p.o.)治疗显著抑制blm诱导的SSc模型皮肤纤维化的发展。基因阵列分析显示MT-7117通过抑制炎症细胞的激活和炎症相关信号发挥抗炎作用;同时提取血管功能障碍作为MT-7117靶向病理。血清蛋白分析显示,多个ssc相关生物标志物包括p -选择素、骨保护素、胱抑素C、生长分化因子-15和S100A9被MT-7117抑制。MT-7117通过抑制TGF-β诱导的人真皮成纤维细胞活化而抑制其活性ACTA2(编码α-平滑肌肌动蛋白)mRNA升高。SSc患者皮肤中的单核/巨噬细胞、中性粒细胞、血管(内皮细胞)、成纤维细胞和表皮(角质细胞)表达MC1R,提示这些MC1R阳性细胞可能是MT-7117的靶点。
结论
MT-7117在SSc临床前模型中显示了疾病修饰作用。对其作用机制的研究和靶点表达分析表明,MT-7117通过影响炎症、血管功能障碍、纤维化等SSc的关键病理机制发挥积极作用。本研究结果提示MT-7117是一种潜在的SSc治疗药物。一项研究MT-7117在早期进展性弥漫性皮肤SSc患者中的疗效和耐受性的2期临床试验正在进行中。
背景
系统性硬化;硬皮病(又称硬皮病)是一种自身免疫性疾病,其主要病理特征为:免疫/炎症调节失调、微血管功能障碍和多器官广泛性纤维化[1].虽然皮肤硬化是SSc的一个显著特征,但肺、胃肠道、肾脏和心脏的病理改变决定了临床结局。特别是,肺的评估和治疗非常重要,因为SSc相关的间质性肺疾病(ILD)是SSc患者死亡的主要原因。虽然皮肤受累本身不是死亡的原因,但疾病早期大量皮肤受累或迅速进展的皮肤受累与死亡率增加和内脏器官受累的流行率有关[2,3.].SSc在自身免疫性风湿病中具有最高的病例特异性死亡率[4].在纤维化过程中,虽然不同器官触发初始损伤的部位和因素往往不同,但已报道在不同器官中存在共同的分子机制[5,6].在这种情况下,皮肤纤维化的途径和机制可以推断为肺纤维化[7].尽管过去几年的深入研究提高了对该病的认识,但只有两种药物:nintedanib (Ofev®)[8和tocilizumab (Actemra®)[9,10],目前已获美国食品和药物管理局(FDA)批准用于治疗ssc相关的ILD。然而,除了SSc相关的ILD之外,目前还没有被批准用于SSc的药物,因此,对于新疗法的巨大需求尚未得到满足,这些新疗法不仅对SSc的肺纤维化有效,而且对包括皮肤在内的许多器官的纤维化也有效。
黑素皮质激素受体(MCR)家族属于G蛋白偶联受体的A类家族,由五个成员组成,其组织分布和功能各不相同:MC1R、MC2R、MC3R、MC4R和MC5R [11].MC1R在多种细胞类型包括黑素细胞、单核细胞、内皮细胞、成纤维细胞和角质形成细胞上的表达已被报道[12].众所周知,MC1R被内源性配体α-黑色素细胞刺激激素(αMSH)激活后,会诱导黑色素细胞产生黑色素,从而导致皮肤和头发色素沉着[13,14].此外,MC1R的激活被认为具有广泛的抗炎作用[15].在体外,有报道称α msh介导的对核因子-κB活化的抑制作用,核因子-κB是一种著名的炎症调控因子[16].大量研究表明,αMSH可抑制促炎细胞因子-肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白细胞介素(IL)-1、IL-6、IL-8、角质细胞衍生趋化因子(KC)和干扰素-γ的产生,并抑制炎性细胞和内皮细胞粘附分子-血管细胞粘附分子-1和e-选择素的表达。此外,αMSH被报道为促炎、非细胞因子调节因子的抑制因子,如诱导型一氧化氮合酶、前列腺素E2和活性氧。αMSH的另一个被提出的抗炎作用是其诱导IL-10, IL-10是角化细胞和单核细胞中细胞因子的一种著名的有效抑制因子[17].在体内,αMSH已被报道在几种疾病模型中显示抗炎作用,如脂多糖(LPS)诱导的脓毒症[18],佐剂性关节炎[19]和葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎[20.)模型。αMSH在脂多糖诱导的皮肤血管炎中也有抗血管功能障碍的报道[21和缺血/再灌注模型[22,23].在与SSc的关系方面,有报道称αMSH在博莱霉素(BLM)诱导的皮肤纤维化模型中有抑制皮肤纤维化的作用,这是目前应用最广泛的SSc动物模型[24],而MC1R信号缺失会加剧blm诱导的小鼠皮肤纤维化[25].这些证据表明,MC1R激动剂具有抗炎、抗血管功能障碍和抗纤维化的作用,在SSc治疗中具有潜力。然而,MC1R在SSc中介导这些作用的机制尚不完全清楚。MC1R在SSc患者中的表达水平和分布信息尚不清楚,仅有少数报道确定受体少量SSc患者皮肤活检样本或皮肤成纤维细胞的基因表达[24,26].
Dersimelagon磷酸(MT-7117)是由三菱田边制药公司合成的一种口服生物可利用小分子,是MC1R的选择性激动剂。MT-7117可作为MC1R的完全激动剂,并且在其他mcr中可选择性用于MC1R。此外,MT-7117通过诱导体内色素沉着可使小鼠和猴子的皮毛颜色变深[27].MT-7117目前正在进行一项三期临床试验(NCT04402489),作为一种潜在的治疗方案,用于有促红细胞生成素原卟啉症或x连锁淋巴增生性综合征光毒性反应史的患者。
在本研究中,我们评估了MT-7117在体外和体内临床前SSc模型中的疗效,重点是抗炎和抗纤维化作用,这突出了它的影响,而不是对黑色素产生的影响。MT-7117疗效评价和作用机制分析的靶器官为肺和皮肤。此外,利用大量患者样本进行免疫染色,详细研究了SSc患者皮肤中MC1R的表达情况。基于这些评估,我们研究了MT-7117治疗SSc的可能性。本文提出的结果为一项正在进行的用MT-7117治疗弥漫性皮肤SSc (dcSSc)患者的2期临床试验(NCT04440592)提供了科学依据[28].
材料和方法
测试物质
三菱田边制药公司合成的MT-7117被溶解在二甲亚砜(DMSO)中用于体外测定,或悬浮在0.5%甲基纤维素溶液中用于体内实验。
blm诱导的皮肤纤维化和肺炎症预防评估
使用10周龄雌性C3H/HeNCrlCrlj小鼠(Charles River Laboratories Japan, Inc.),所有动物实验均按照三菱田边制药公司《动物实验指南》(批准文号:BJ14-0699)进行。老鼠的背部被剃光,背部中间用油基红墨水做了标记。从第0天到第25天,每天在标记部位皮下注射一次磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)或BLM (Nippon Kayaku, Tokyo, Japan) (0.15 mg/0.1 mL /只动物)(由于反复注射BLM显著降低小鼠体重,所有组均暂停注射几次)。0.1 mL/10 g体重的MT-7117溶液每天口服一次(大约在注射BLM前2小时),连续29天,从第0天开始,直到评估结束前的第28天。第29天,异氟烷吸入麻醉小鼠实施安乐死,并采集全血和背部皮肤样本。左肺解剖,称重,浸入RNAlater溶液(Qiagen, Hilden, Germany)。采集的血液分离成血清。切除皮肤注射部位,称(湿重),浸泡于含0.3 mg/mL胃蛋白酶的0.5 mol/L醋酸溶液中溶解胶原蛋白。溶解样品的胶原蛋白含量使用QuickZyme可溶性胶原蛋白测定试剂盒(QuickZyme Biosciences, Leiden, Netherlands),吸光度由酶标仪(VERSAmax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)测定。使用大鼠/小鼠SP-D试剂盒YAMASA EIA (YAMASA Corporation, Choshi, Japan)测定血清中表面活性物质蛋白D (SP-D)的水平,并用酶标仪(VERSAmax)测定吸光度。 Total RNA of lungs was isolated using RNeasy 96 Universal Tissue Kit (Qiagen) according to the manufacturer’s instructions. Real-time PCR was performed using the One Step SYBR PrimeScript PLUS RT-PCR Kit (Takara Bio Inc., Kusatsu, Japan) and ABI PRISM 7900HT Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Takara perfect real-time primer pairs (Takara Bio Inc.) were used to analyze the gene expression of chemokine CC ligand-2 (Ccl2,亦称单核细胞趋化蛋白-1 (Mcp-1), MA066003),白细胞介素-6 (il - 6, MA039013)和次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(产生HprtMA031262)。定量采用对比CT(周期阈值)法产生Hprt作为管家基因。
MT-7117的药代动力学研究
采用上述blm诱导的SSc模型(预防性评估)对MT-7117进行药代动力学研究。每天1次口服MT-7117,连续29天,在最后一次给药后的1、3、6和24 h每个采样点采集单个小鼠全血,从血液中分离血清。采用API 5000 MS/MS系统(AB Sciex)与安捷伦1200 HPLC(安捷伦科技公司,Santa Clara, CA, USA)联用,测定血清MT-7117的浓度。
预先建立blm诱导的皮肤纤维化治疗评价
采用预先建立的blm诱导的皮肤纤维化模型评估MT-7117的治疗效果如前所述[29,简述如下。使用6 ~ 7周龄雌性C57BL/6小鼠(苏黎世大学实验动物服务中心),所有动物实验均按照欧洲共同体理事会《实验动物护理和使用指令》和瑞士法律(批准号:ZH002/17)进行。将BLM (Baxter AG, Deerfield, IL, USA)溶于生理盐水中,每隔一天在上背部指定区域皮下给药(每只动物0.1 mg/0.1 mL),持续6周(第1 - 42天)。在实验期的最后3周(第22 - 42天),小鼠每天口服一次MT-7117、伊马替尼(Selleckchem, houston, TX, USA)或载药。第43天处死小鼠2采集吸入、背部皮肤和血清样本。
小鼠皮肤样本在4%的福尔马林中固定,并包埋在石蜡中。苏木精和伊红(HE)染色按标准程序进行。皮肤厚度是通过使用带有图像分析程序的显微镜测量he染色皮肤样品的厚度来确定的(Zeiss Imager Z1, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany)。每片he染色小鼠皮肤样品随机选取3张100倍放大的不重叠照片(每张6张,18次测量),测量皮肤厚度。分析由两名独立的检验员以盲法进行。每个皮肤厚度的平均值为36次测量值。
α-平滑肌肌动蛋白(αSMA,编码于ACTA2皮肤切片染色。脱脂和复水后,10%山羊血清(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)用于防止非特异性抗体结合。在室温下用一抗(1:50 0,单克隆小鼠抗-αSMA,克隆1A4, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)孵育1小时,然后在室温下用碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠二抗(Dako, Glostrup, Denmark)孵育30分钟。使用显微镜和蔡司图像分析程序(Zeiss Imager Z1)手工测定皮肤中α sma阳性肌成纤维细胞的数量。随机选取6个不重叠区域(172.5 × 218 μm、37605 μm),记录6张切片,定量检测小鼠皮肤α sma阳性肌成纤维细胞2)每片小鼠皮肤400倍放大。两名独立的审查员以盲法进行了分析。37605 μm范围内α sma阳性肌成纤维细胞数量2计算为12个值的平均值。
皮肤切片按标准程序进行Masson三色染色。在显微镜下用蔡司图像分析程序(Zeiss Imager Z1)在100倍放大下观察Masson三色切片。
基于芯片的基因表达分析
使用Agilent表达阵列进行基因表达谱分析
采用blm诱导SSc模型(预防性评价)的pbs_载体(无病对照组)、blm_载体(有病对照组)和BLM_MT-7117 (0.3 mg/kg)小鼠肺组织标本进行总RNA分析。用NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)和Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies)确认RNA样品的纯度、浓度和质量。然后使用低输入快速Amp标记试剂盒(Agilent Technologies)对RNA进行cy3标记。将标记的cRNA样本进行片段化,然后使用基因表达杂交试剂盒(Agilent Technologies)与安捷伦SurePrint G3 Mouse GE v2 8 × 60 K芯片进行杂交。杂交后,用Gene Expression Wash Buffers Pack (Agilent Technologies)清洗芯片,并用扫描仪成像以检测信号。使用Agilent特征提取软件12.0评估信号强度。
生物信息学分析
利用genspring GX 14.9.1、Ingenuity路径分析(IPA) 2019秋季和Microsoft Excel 2010软件进行生物信息学分析。与PBS_vehicle组比较,BLM_vehicle组基因波动≥2倍,且满足ap-值< 0.05的被调节者t-test定义为“疾病模型中的差异表达基因(DEGs)”。在DEGs中,MT-7117处理组的基因反向波动≥1.5倍,满足ap-值< 0.05的被调节者t-试验与blm_对照组的比较定义为“经MT-7117处理的DEGs”。我们将DEGs输入IPA并执行两种类型的计算:“规范路径”和“疾病或功能”。在本报告中,“规范途径”被描述为“途径”,“疾病或功能”被描述为“类别”。前者包含一系列基因相互作用的列表,后者是与疾病和生物功能相关的列表。这些数据集在IPA软件中注册。最初,费雪的精确检验被用来计算两组基因重叠的概率。随后,下游效应分析(DSEA) [30.]来计算激活z分数。DSEA是一种基于基因和功能之间预期的因果效应来预测表达模式变化方向(激活或抑制)的技术。根据DSEA分析的结果,提取了可能参与SSc发病的细胞类型(巨噬细胞、中性粒细胞、单核白细胞、t淋巴细胞、b淋巴细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、上皮细胞和成纤维细胞)的信息。随后,我们提取了参与SSc发病的生物学功能和分子信号通路信息,如炎症/免疫异常、血管功能障碍、纤维化等。
血清蛋白分析
从blm诱导的SSc模型小鼠(治疗评价)中提取血清样本。取saline_vehicle(无病对照组)、BLM_vehicle(有病对照组)、BLM_MT-7117 (10 mg/kg)和BLM_imatinib (150 mg/kg)组样品进行分析。使用Luminex®检测(R&D系统,明尼阿波利斯,MN,美国),研究了110个蛋白(补充表S1).分析满足下列任何标准的蛋白质:(i)所有样品都在定量范围内充分测量;(ii)在一个或多个组中,半数以上的样本被定量,尽管有些样本超出了定量范围。将超出定量范围的样品值替换为在上下限范围内的样品值。
皮肤活检样本和成纤维细胞分离(成纤维细胞试验)
全层皮肤活检取材于dcSSc患者的临床受累皮肤,这些患者来自英国利兹风湿病和肌肉骨骼医学研究所的硬皮病诊所。对照皮肤样本来自健康捐赠者。所有dcSSc患者和健康捐赠者均通过硬皮病进展风险分层(STRIKE SSC)提供书面知情同意,该分层已得到东北研究伦理委员会(编号15/NE/0211)的批准。SSc患者符合2013年ACR/ euler SSc分级标准[31]并根据LeRoy和Medsger标准被归类为dcSSc [32].
从健康供者和SSc患者的皮肤活检样本中分离真皮成纤维细胞。皮肤活检样本用刀切碎,放置在塑料培养皿中,用Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)覆盖,其中4.5g/L葡萄糖(Thermo Fisher Scientific),添加20%胎牛血清(FCS, Thermo Fisher Scientific), 1%青霉素和链霉素(Merck, Darmstadt, Germany), 1 μg/ml两性霉素(Thermo Fisher Scientific),在37°C, 5% CO的湿化环境中培养2.3天后再加入不含两性霉素的培养基。7 d后更换含10% FCS的培养基,每2 ~ 3 d补充一次。当获得可见的细胞生长时,成纤维细胞传代。简单地说,用含0.1%乙二胺四乙酸(EDTA)的PBS孵育细胞5分钟,然后用胰蛋白酶- EDTA溶液(默克公司)分离,培养至70-80%融合在DMEM (1 g/L葡萄糖)中,其中添加10% FCS和1%青霉素和链霉素。在随后的传代后,如前所述,用人类端粒酶逆转录酶使原代细胞逆转录不朽[33].
成纤维细胞的治疗
细胞生长在六孔培养板中融合,然后在DMEM 1% FCS中饿死血清24小时,然后在转化生长因子-β1 (TGF-β1, 10 ng/mL) (Sigma-Aldrich)存在或不存在的情况下孵育24小时。TGF-β1刺激培养液时加入MT-7117或αMSH (Peptide Institute, Osaka, Japan)。在所有不含mt -7117的孔中加入DMSO(0.1%),以使DMSO对细胞的影响归一化。
RNA分离和实时PCR分析(成纤维细胞法)
根据制造商的说明书(Zymo Research Corporation, Irvine, CA, USA),使用Zymo快速RNA迷你准备试剂盒提取总RNA。利用高容量cDNA逆转录试剂盒(Thermo Fisher Scientific)合成第一链cDNA。使用SYBR Green RT-PCR Mastermix试剂盒(Thermo Fisher Scientific)和ABI PRISM 7500 Fast Real-Time PCR系统(Applied Biosystems)对3个副本进行定量RT-PCR。采用对比CT法,甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)是持家基因。用于qPCR分析的引物序列如下:GAPDH正向5 ' -ACC CAC TCC TCC ACC ACC TTT GA-3 ',反向5 ' -CTG TTG CTG TAG CCA AAT TCG T-3 ';ACTA2正向5 ' -TGT ATG TGG CTA TCC AGG CG-3 ',反向5 ' -AGA GTC CAG CAC GAT GCC AG-3 ';和I - 1型胶原蛋白(COL1A1)正向5 ' -GCT CCG ACC CTG CCG ATG TG-3 ',反向5 ' -CAT CAG GCG CAG GAA GGT CAG C-3 '。
皮肤活检标本(MC1R免疫组化分析)
对dcSSc患者的临床受累皮肤进行全层皮肤活检(n= 50)或局限性皮肤SSc (lcSSc,n= 10)从德国埃尔兰根-纽伦堡大学招募的。对照皮肤样本(n= 30)来自健康捐赠者。所有SSc患者和健康捐赠者均提供经机构伦理委员会批准的书面知情同意。SSc患者符合2013年ACR/ euler SSc分级标准[31]并根据LeRoy和Medsger标准被归类为dcSSc [32].这项研究得到了埃尔兰根-纽伦堡大学医学院(编号3766)伦理审查委员会的批准。
免疫组化分析MC1R
单染色
用抗MC1R单克隆抗体(1:50,克隆EPR6530;Abcam,英国剑桥)。用过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(Dako)作为二抗。同型匹配的抗体作为对照。使用3,3 ' -二氨基联苯胺(Sigma-Aldrich)和过氧化物酶底物溶液(Sigma-Aldrich)观察染色情况。使用Meyer氏苏木素(J.T. Baker, phillips sburg, NJ, USA)进行核反染色。对于永久安装,部分脱水和干燥,然后使用Pertex (Histolab,哥德堡,瑞典)安装。定性评估是在确定每种染色细胞类型和组织成分后,根据染色强度进行评分(阳性细胞的数量不考虑评分)。评价染色强度分级为:未染色为0分,弱染色为0.5分,淡染色为1分,中染色为2分,暗染色为3分。
双染色
为了确定皮肤中MC1R阳性的细胞类型,从单MC1R阳性的样本中随机选取9或10个样本,对感兴趣的细胞类型进行双染色。用上述方法反应抗mc1r单克隆抗体。使用Alexa Fluor 488标记的驴抗兔二抗(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)作为二抗。随后,使用以下针对细胞特异性标志物的抗体进行双染色:抗prolyl-4-羟化酶β抗体(1:50,Acris antibody, Herford, Germany)用于成纤维细胞,抗cd68抗体(1:200,Biolegend, San Diego, CA)用于单核/巨噬细胞,抗cd66b抗体(1:250,Biolegend)用于中性粒细胞,抗cd31抗体(1:50,R&D Systems)用于内皮细胞。使用Alexa Fluor 594 (Invitrogen公司,Carlsbad, CA, USA)标记的抗体作为第二抗体。核反染使用4 ',6 ' -二氨基-2-苯基吲哚(Sigma-Aldrich)。使用尼康Eclipse 80i显微镜(尼康,东京,日本)对组织切片进行免疫荧光染色分析。
统计分析
所有定量药理学数据均以平均值±标准差(SEM)表示。各研究组之间的统计差异评估如下。所有分析均采用SAS系统进行,检验采用双尾显著性水平< 0.05或单尾显著性水平< 0.025。
blm诱导的SSc小鼠模型预防评价
用Student’s量表分析PBS_vehicle(无疾病对照组)与BLM_vehicle(有疾病对照组)的差异t以及。使用Williams检验分析BLM_vehicle和mt -7117处理组之间的差异。根据重复测量的方差分析(群体效应和交互效应;组×时间点),体重差异有统计学意义(p< 0.01)。因此,采用Student’s量表分析PBS_vehicle组与BLM_vehicle组各时间点体重的差异t -测试。使用Williams检验分析BLM_vehicle和mt -7117处理组之间的差异。
blm诱导SSc小鼠模型治疗评价
采用Wilcoxon检验(双侧)分析saline_vehicle(无疾病对照组)与BLM_vehicle(有疾病对照组)以及BLM_vehicle与伊马替尼治疗组之间的差异。采用Shirley-Williams多元比较试验(单侧)分析BLM_vehicle与mt -7117处理组之间的差异。
血清蛋白分析
使用Student’s分析saline_vehicle与BLM_vehicle组、BLM_vehicle与mt -7117处理组、BLM_vehicle与伊马替尼处理组之间的差异t以及。
结果
MT-7117对blm诱导的皮肤纤维化和肺预防炎症评价的影响
采用blm诱导的皮肤纤维化和肺炎症模型评价MT-7117的预防治疗效果。我们发现,每天皮下注射高剂量BLM不仅能诱导皮肤纤维化,还能诱导肺部炎症,同时评价两个终点的实验条件优化如下:从第0天到第25天,每天皮下注射BLM (0.15 mg/只)1次,从第0天到第28天,每天口服MT-7117 1次,随后在第29天测量终点(图)。1A).皮下注射BLM使小鼠从第0天到第29天体重下降,MT-7117≥0.3 mg/kg时显著提高小鼠体重(图;1B)皮下注射BLM可明显增加皮肤胶原蛋白含量,提示皮肤纤维化进展(图1)。1C)。同样,注射BLM可显著提高血清SP-D(肺泡上皮II型细胞分泌的肺损伤标志物[36)和左肺的湿重Ccl-2/Mcp-1而且il - 6肺组织中mRNA的表达,提示肺炎症的进展(图。1当MT-7117≥0.3 mg/kg时,这些增加被显著抑制(图。1上述结果表明,在相同的剂量范围内,MT-7117预防性治疗对皮肤纤维化和肺部炎症具有剂量依赖性。此外,我们还确定了该模型中MT-7117的血清浓度。小鼠模型反复口服MT-7117 29天后,MT-7117血清浓度随剂量增加而增加C马克斯在0.3 mg/kg时,12.14 ng/mL (= 17.97 nmol/L)。1H). MT-7117对EC对小鼠MC1R有体外激动作用500.77 ng/mL (= 1.14 nmol/L) [27].这些结果表明MT-7117的全身暴露水平合理地超过了EC50小鼠MC1R的激动活性值。
MT-7117在博莱霉素(BLM)诱导的系统性硬化症(SSc)模型预防评价中对皮肤纤维化和肺炎症的影响从第0天到第25天,每天在小鼠背部皮肤相同区域注射BLM。小鼠每天一次口服MT-7117或对照剂,连续29天(第0 - 28天)。各样品于第29天采集。一个实验进度。B实验期间测量小鼠体重。C测量皮肤胶原蛋白含量。D评估左肺湿重。E测定血清表面活性物质蛋白D (SP-D)。F,G趋化因子CC配体2的表达(Ccl2 / Mcp-1)及白细胞介素-6 (il - 6)测定肺组织中相对于次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1的mRNA (产生Hprt).B- - - - - -E每列表示平均值±SEM (n除mt -7117处理组0.03 mg/kg外,所有组均为10,其中n= 9)。# #p使用学生量表时BLM比PBS < 0.01t以及;**p使用Williams检验,BLM vs. MT-7117 < 0.005。H在此模型中,重复口服给药29天后血清MT-7117的浓度。每个符号表示平均值±SD (n=每个时间点3)。虚线表示小鼠MC1R激动活性的EC50
MT-7117对预先建立的blm诱导的皮肤纤维化治疗评价的影响
本研究采用blm诱导的皮肤纤维化模型,在小鼠皮肤部分纤维化后给药MT-7117,评价其治疗作用。在轻度条件下,每隔一天注射比上述BLM模型更低剂量的BLM进行预防评价,6周后逐渐诱导皮肤纤维化。BLM (0.1 mg/只)每隔一天皮下注射一次,持续6周,在实验期间的最后3周,每天口服一次MT-7117、伊马替尼或载药。第2组设为给药开始时反映纤维化状态的组,注射BLM 3周,再注射生理盐水3周(图2)。2A)皮下注射BLM 6周后,皮肤厚度明显增加(图2)。2B)和αSMA阳性肌成纤维细胞数量(αSMA被称为成纤维细胞活化和肌成纤维细胞转分化标志[37])在真皮层(图。2C). Masson’s三色染色,观察BLM注射后真皮致密胶原纤维堆积,真皮白色脂肪组织丢失(图;2D)延长BLM注射6周与注射3周后再注射生理盐水3周相比,有增加皮肤纤维化程度的趋势。3和10 mg/kg时,MT-7117显著抑制blm诱导的皮肤厚度和α sma阳性肌成纤维细胞的增加(图。2MT-7117可改善blm诱导的真皮白色脂肪组织丢失(图2)。2D)。同样,伊马替尼,一种酪氨酸激酶抑制剂作为阳性对照[38, 150 mg/kg也能改善这些参数。MT-7117处理组与BLM处理3周、生理盐水处理3周的2组基本相同,说明MT-7117处理3周后几乎完全抑制纤维化的进展(图7117)。2这些结果表明,MT-7117可以抑制皮肤纤维化的发展,即使在部分诱导纤维化后进行药物干预,但它不太可能逆转已存在的纤维化。低于3mg /kg的剂量未在该模型中进行测试。最低有效剂量应在今后的研究中确定。
MT-7117对预先建立的blm诱导SSc模型皮肤纤维化的影响-治疗评价。每隔一天将BLM注射到小鼠背部皮肤,连续6周。在实验期的最后3周,小鼠每天口服一次MT-7117、伊马替尼或赋形剂。第43天取皮肤标本,石蜡包埋。一个实验进度。B通过测量he染色皮肤的厚度来确定皮肤厚度。Cα-平滑肌肌动蛋白(αSMA,编码于Acta2)石蜡包埋皮肤染色。测定皮肤特定区域α sma阳性肌成纤维细胞的数量。D各组背侧皮肤Masson三色染色代表性图像。B,C每列表示平均值±SEM (n= 8)。#p< 0.05,# #pWilcoxon检验(双侧),组3与组1、组3与组6比较均< 0.01,*p< 0.025, * *p使用雪莉-威廉姆斯测试(单侧),组3 vs组4和组5 < 0.005
利用基因芯片分析MT-7117的作用机制
为了探讨MT-7117的作用机制,我们进行了基于微阵列的基因表达分析。小鼠肺组织样本的DNA芯片分析数据来自blm诱导的SSc模型(预防性评估)。疾病模型中DEGs为3337个,MT-7117治疗组为1477个。主成分图显示,PBS_vehicle、BLM_vehicle和mt -7117处理组明显分为不同的聚类(图7)。3.一个)。
MT-7117处理的blm诱导SSc模型肺组织的微阵列基因表达谱。采用0.3 mg/kg MT-7117处理blm诱导的SSc模型(预防性模型)的肺样本进行DNA芯片分析。使用IPA软件进行生物信息学分析,对两组数据集进行两种计算:“Canonical pathway”和“Diseases or function”。采用下游效应分析计算活化z分数。一个PBS_vehicle、BLM_vehicle和BLM_MT-7117组的基因表达谱主成分分析。B通过BLM和MT-7117处理改变的细胞类型分类。类别(C)和信号通路(D与BLM和MT-7117治疗后SSc病理生理改变有关。符号的颜色表示激活(红色)或失活(绿色),大小反映p -价值。E参与IL-6信号转导的波动基因。FIL-6信号通路图:PBS与BLM组(左)和BLM与MT-7117组(右)的波动。红色:表达增加;绿色:减少表达式;实线:直接关系;虚线:间接关系
使用IPA软件分析的结果如下所述(用于制备图的原始数据。3.均列于附表S2).在对与SSc病理相关的细胞类型的分析中,BLM_vehicle或mt -7117处理组中改变的类别,其中的绝对值z-score≥2见图。3.B.大量与巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞相关的细胞种类被提取出来,其次是内皮细胞相关的细胞种类,提示这些细胞是MT-7117在blm诱导的SSc模型中的主要靶细胞。t淋巴细胞和内皮细胞相关类别不受BLM改变,但被MT-7117抑制,b淋巴细胞和成纤维细胞相关类别均不符合提取标准。在生物学功能分析中,BLM激活炎症反应(与炎症相关)、抗原提呈细胞激活(与免疫异常相关)、血管生成、动脉粥样硬化、血管生成和血管闭塞(与血管功能障碍相关)的类别,MT-7117抑制(图7117)。3.C)。在聚焦于分子信号通路的分析中,MT-7117治疗导致了炎症分子信号通路的抑制,包括触发髓系细胞-1 (TREM1)、IL-6和肿瘤抑制素M上的受体表达,以及与纤维化相关的过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)信号通路的激活(图7)。3.D)。
在IL-6信号方面,构成IL-6信号通路的各个基因的基因表达变化如图所示。3.E和在通路图上显示(图。3.F)。MT-7117逆转了BLM诱导的基因表达波动,无论相关基因是在IL-6通路的上游(参与IL-6表达)还是下游(响应IL-6的基因)(图6)。3.E, F)。在IL-6信号通路的组成基因中,BLM显著上调IL-6基因本身的表达,MT-7117下调最多(图7117)。3.E、F)。
MT-7117血清生物标志物分析
为了探索MT-7117的血清生物标志物,我们使用blm诱导的SSc模型(治疗评价)获得的血清样本进行血清蛋白分析。Luminex®检测共研究了110个血清蛋白谱(测量因素列于补充材料,表s1).在测量的110个蛋白质中,67个符合材料和方法中描述的分析标准(67个蛋白质的结果显示在补充图s1).BLM显著升高脂联素、胱氨酸抑制素C、生长和分化因子-15 (GDF-15)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-3、骨保护素、p选择素、S100A9、肿瘤坏死因子受体(TNFR) I、TNFRII和金属蛋白酶组织抑制剂-1 (TIMP-1)的浓度,而MT-7117显著抑制这些升高(图7117)。4).
MT-7117对人成纤维细胞活化的影响
为了评估MT-7117对皮肤成纤维细胞的抗纤维化作用,我们下一步评估了MT-7117对皮肤成纤维细胞的影响ACTA2而且COL1A1TGF-β刺激诱导mRNA表达。在含TGF-β-的培养基中培养24 h后,饥饿24 h后,细胞中ACTA2而且COL1A1在健康真皮成纤维细胞中有mRNA表达。MT-7117抑制TGF-β诱导的TGF-βACTA2mRNA升高呈浓度依赖性,但对其无影响COL1A1信使rna表达。使用MC1R内源性配体αMSH处理时也观察到类似的趋势(图1)。5A).此外,我们评估了MT-7117和αMSH对来自SSc患者的皮肤成纤维细胞的影响。MT-7117和αMSH可抑制TGF-β诱导的细胞凋亡增高ACTA2从SSc患者和健康供者的成纤维细胞中,1000 nmol/L浓度下的mRNA表达(图)。5B).这些结果提示MT-7117通过抑制TGF-β诱导的成纤维细胞活化而具有抗纤维化作用。
人皮肤中MC1R免疫染色分析MT-7117靶点
免疫组化分析了健康供体和SSc患者皮肤活检中是否存在MC1R。捐献者的特征总结于表中1.单染色显示,dcSSc患者皮肤的成纤维细胞/单核细胞、血管和表皮主要可见MC1R免疫反应(图1)。6A).为了定性评价,将MC1R免疫反应性分为四类分别评分:总野、血管、表皮和成纤维细胞/单核细胞(成纤维细胞和单核细胞由于单染无法区分,故不作区分分析)。30例健康供体中有24例,50例dcSSc患者中有40例,10例lcSSc患者中有9例MC1R阳性。MC1R染色强度评分在健康、dcSSc和lcSSc患者的所有组织成分中相似(表2;Fig.年代2显示单独的情节)。在所有类别的组织元件中,MC1R和改良的Rodnan皮肤评分(mRSS)之间没有明显的相关性(补充图s3.).这些结果表明,无论疾病活动度如何,MC1R在SSc患者中表达频繁。
为了确定dcSSc患者中MC1R阳性细胞的细胞类型,我们使用了一种双染色方案,用细胞特异性标记物共同染色MC1R。mc1r阳性细胞主要为单核/巨噬细胞,少部分为成纤维细胞、内皮细胞和中性粒细胞染色(图1)。6B)。
讨论
本研究结果表明MT-7117可改善blm诱导的SSc小鼠模型的皮肤纤维化和肺炎症。对MT-7117在blm诱导的SSc模型中的作用机制的分析表明,其主要作用是通过抑制单核/巨噬细胞等炎症细胞的活化以及抑制IL-6等炎症相关信号的传递而起到抗炎作用。也有证据表明MT-7117通过作用于内皮细胞来抑制血管功能障碍。此外,MT-7117通过抑制体外成纤维细胞活化表现出抗纤维化作用。因此,MT-7117通过调节SSc的所有三个基本特征、炎症、血管功能障碍和纤维化发挥疾病修饰作用[6].根据这些结果,MT-7117的作用机理如图所示。7.
对MT-7117在肺组织中的作用机制进行的DNA芯片分析显示,MT-7117主要针对炎症相关的种类和通路。值得注意的是,BLM强烈诱导IL-6本身和IL-6通路相关基因,MT-7117明显抑制IL-6。IL-6是一种重要的炎症细胞因子,抗IL-6受体或抗IL-6抗体已被批准用于治疗类风湿关节炎等炎症性疾病[39].最近,抗il -6受体抗体tocilizumab (Actemra®)被美国FDA批准用于ssc相关的ILD [9,10].因此,强烈抑制IL-6信号转导的MT-7117也有望对ssc相关的ILD有效。此外,有趣的是,血管功能障碍是SSc最早和可能的主要事件[40],提取为MT-7117靶向病理。血清蛋白分析显示MT-7117抑制p -选择素和骨保护素的表达。已知这些分子与血管功能障碍相关,并在各种疾病(包括SSc)中血管损伤患者的血浆中升高[41,42,43,44].这些血清蛋白图谱的结果支持了DNA芯片的结果,证明MT-7117对血管功能障碍的影响。如“背景”部分所述,有报道称MC1R的体内配体αMSH在几种动物模型中具有抗血管功能障碍的作用[21,22,23].这些证据表明MT-7117对与SSc相关的疾病有效,如雷诺现象、指溃疡和肺动脉高压,这些都与血管功能障碍密切相关。MT-7117对血管内皮细胞和平滑肌细胞的直接作用应在未来的研究中明确。此外,BLM治疗评价模型的血清蛋白分析显示,BLM可诱导多种因素,MT-7117可抑制多种因素。值得注意的是,这些因素大多在SSc患者的血液中增加,并与SSc症状相关[36]:胱抑素C与SSc患者右心功能相关[45];GDF-15与器官受累相关(特别是与肺部疾病相关)[46];骨保护素与Medsger皮肤评分相关[47]以及lcSSc患者的增加[44];p -选择素与健康评估问卷残疾指数相关[43];S100A9在肺纤维化或自身抗体阳性患者中较高[48];TIMP-1在血清中含量高[49];TNFRI和TNFRII在血清和皮肤中的T细胞中含量很高[50].此外,在blm诱导的SSc模型中,SP-D被MT-7117抑制,与SSc患者的肺功能[一氧化碳肺扩散能力%和肺活量%]呈负相关[51].这些发现表明BLM模型和SSc病理之间存在相似性,上述因素是评估MT-7117的潜在预测和药理学生物标志物。
MT-7117抑制人成纤维细胞活化被认为是一个重要的结果,表明MT-7117通过直接靶向成纤维细胞发挥抗成纤维作用,不仅在动物模型中起作用,而且在人成纤维细胞上也起作用。此外,MT-7117对来自SSc患者和来自健康供者的皮肤成纤维细胞的影响是相似的。这是MT-7117治疗SSc临床前评估的一个重要结果。MT-7117对胶原mRNA表达没有抑制作用,这与之前在类似的检测系统中评价αMSH的报道一致[52].在本研究中,αMSH不抑制COL1A1但抑制I型前胶原c端肽的分泌,提示存在一种转录后机制,如抑制前胶原切割c端肽所需的肽酶。需要进一步的研究来阐明MT-7117调节胶原蛋白生成的机制。
据我们所知,我们的研究首次在多达50名SSc患者的皮肤样本中研究了MC1R在蛋白水平上的表达分布。免疫染色分析MC1R的表达,证实MC1R在SSc患者皮肤的单核/巨噬细胞、中性粒细胞、血管(内皮细胞)、成纤维细胞和表皮(角质细胞)中表达。因此,这些mc1r阳性细胞可能是MT-7117的靶点,这一假设与利用临床前SSc模型研究MT-7117的作用机制的结果是一致的。重要的是,这些细胞类型在炎症、血管功能障碍和纤维化中发挥核心作用,这表明MT-7117对各种靶细胞的作用可能协同促进其疾病修饰作用。然而,MC1R的表达水平在患者间存在差异,分别在20%的dcSSc和10%的lcSSc患者中未检测到MC1R。这引起了人们对MT-7117疗效可能因人而异的关注。疗效与MC1R表达水平之间的相关性应在临床试验中使用新鲜制备的皮肤活检标本进行验证。由于研究的局限性,以下几点不能充分讨论:(i)由于已知MC1R信号的激活可以抑制SSc病理纤维化[24,25,26],预测SSc患者与健康受试者相比,配体表达降低和/或受体信号减弱。遗憾的是,本研究并未对αMSH的表达水平进行评估。(ii)由于双染色法评价表达MC1R的细胞类型的样本较少,本研究仅限于对每种细胞类型中MC1R表达的定性评价。为了解决上述问题,将需要进行进一步的评价。
结论
综上所述,本研究结果表明MT-7117通过其对炎症细胞、内皮细胞和成纤维细胞的多功能化作用,对炎症、血管功能障碍和纤维化的病理产生积极影响。鉴于MT-7117对SSc的所有三种基本病理都有潜在的有益影响,因此它是一种潜在的治疗具有临床挑战性的SSc的药物,SSc具有多样且难以治疗的症状。一项研究MT-7117在皮肤弥漫性SSc患者中的疗效和耐受性的2期临床试验目前正在进行中(NCT04440592)。
数据和材料的可用性
本研究中产生或分析的数据集可根据需要从通信作者处获取。
目前研究中使用的微阵列数据可以在国家生物技术中心信息基因表达综合数据库(GSE 199581)中找到。
缩写
- 受体:
-
肾上腺皮质受体
- SSc:
-
系统性硬化病
- BLM:
-
博来霉素
- TGF-β:
-
转化生长因子-β
- 订单。
-
口服
- αSMA:
-
α-平滑肌肌动蛋白(由ACTA2)
- 食品药品监督管理局:
-
食物及药物管理局
- ILD:
-
间质性肺病
- 要看更多有关憩苑α:
-
α促黑激素
- TNF-α:
-
肿瘤坏死因子-α
- IL:
-
白介素
- 余:
-
Keratinocyte-derived趋化因子
- dcSSc:
-
弥漫性皮肤SSc
- DMSO溶液:
-
二甲亚砜
- PBS:
-
磷酸盐
- SP-D:
-
表面活性剂蛋白D
- Ccl2:
-
趋化因子CC ligand-2
- MCP-1:
-
单核细胞趋化蛋白1
- 产生Hprt:
-
次黄嘌呤phosphoribosyltransferase
- CT:
-
循环阈值
- 他:
-
苏木精和伊红
- 度:
-
差异表达基因
- 状态参量:
-
下游效应分析
- DMEM:
-
杜尔贝科改良的鹰式培养基
- FCS:
-
胎牛血清
- EDTA:
-
乙二胺四乙酸
- GAPDH:
-
Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶
- COL1A1:
-
I型胶原蛋白1
- lcSSc:
-
皮肤的SSc有限
- 扫描电镜:
-
均值的标准误差
- 电子商务50:
-
最大有效浓度一半
- TREM-1:
-
髓系细胞上表达的触发受体-1
- PPAR:
-
过氧物酶体proliferator-activated受体
- GDF-15:
-
生长分化因子-15
- MMP的:
-
基质金属蛋白酶
- TNFR:
-
肿瘤坏死因子受体
- TIMP-1:
-
组织金属蛋白酶抑制剂-1
- 夫人:
-
修改罗德南皮肤评分
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确认
我们感谢西明藤博士的建议和项目管理。我们感谢关典康博士、石井秋娜博士和梅田幸子博士对BLM研究(预防)的技术支持。感谢Prof. Oliver Distler和Prof. Zhongning Guo对BLM(治疗性)研究的贡献。我们感谢Katja Dreißigacker博士、Lena Summa、Regina Kleinlein博士和Hiroshi Matsuura博士对SSc患者组织学分析的贡献。我们感谢津田实、井亮介和Hikida久美子博士对药代动力学研究的贡献。
资金
一个也没有。
作者信息
作者和联系
贡献
研究概念:MK、TS、YK;数据采集:图1_TS、YK、MM;图2 _gk、铅;图3_MK, SK, AM;图4 _mk YK;图5_RR, PM, FD;图6 _yz JD;数据分析与解读:MK、TS、YK、SK、MM、AM;起草稿件:MK和TS;审阅稿件:YK、SK、MM、AM、GK、PB、RR、PM、FD、TZ、JD; final approval of the manuscript: all authors.
相应的作者
道德声明
伦理认可和同意参与
blm诱导的SSc小鼠模型预防评价:研究按照三菱田边制药公司《动物实验指南》(批准文号:BJ14-0699)进行。
blm诱导的SSc小鼠模型治疗评价:本研究根据欧洲共同体理事会《实验室动物护理和使用指令》和瑞士法律(批准号:ZH002/17)进行。
皮肤活检样本和成纤维细胞分离(成纤维细胞试验):所有dcSSc患者和健康供者通过硬皮病进展风险分层(STRIKE SSC)提供书面知情同意,该分层已得到东北研究伦理委员会(批准号15/NE/0211)的批准。
皮肤活检样本(MC1R的免疫组织化学分析):该研究已获得埃尔兰根-纽伦堡大学医学院伦理审查委员会批准(编号3766)。所有SSc患者和健康捐赠者均提供经机构伦理委员会批准的书面知情同意。
相互竞争的利益
F. Del Galdo教授获得了Abbvie、AstraZeneca、Boehringer-Ingelheim、Capella、Chemomab、Kymab、Janssen和Mitsubishi-Tanabe的费用和研究支持。
J.H.W. Distler教授从Actelion、Active Biotech、Anamar、ARXX、aTyr、拜耳制药、勃林格殷格翰、Celgene、加拉帕哥斯、GSK、Inventiva、JB Therapeutics、Medac、辉瑞、赛诺菲-安万特、RedX、瑞益和UCB获得咨询费、讲费和/或酬金。J. H. W. Distler是4D Science的股东,也是FibroCure的科学负责人。
M. Kondo, T. Suzuki, Y. Kawano和S. Kojima是三菱田边制药公司的员工。
额外的信息
出版商的注意
卡塔尔世界杯常规比赛时间施普林格《自然》对出版的地图和机构附属关系中的管辖权要求保持中立。
补充信息
附加文件1:图s1。
MT-7117处理blm诱导的SSc模型的血清蛋白分析。使用10 mg/kg MT-7117或150 mg/kg伊马替尼处理blm诱导的SSc小鼠模型(治疗模型)的血清样本进行血清蛋白分析(所有可以定量的蛋白)。使用Luminex®试剂盒对110个蛋白进行了研究。图中显示了67种在定量范围内可检测到的蛋白质。所有值都表示为单个图点,平均值±SEM (n= 8)。*p< 0.05, * *p学生t检验(vs. BLM_vehicle组)< 0.01。
附加文件2:图s2。
皮肤切片黑素皮质素-1受体(MC1R)免疫染色评分。健康受试者皮肤样本中MC1R的染色强度(n= 30), dcSSc患者(n= 50),和lcSSc (n= 10例,0 ~ 3分。定性评估是在确定每种染色细胞类型和组织成分后,根据染色强度进行评分。没有染色,0;微弱的染色,0.5;光染色,1;温和的染色,2;深色染色:3。所有值都表示为单个图点和平均值±SEM。
附加文件3:图s3。
dcSSc患者MC1R评分与mRSS的相关性研究。dcSSc患者皮肤中MC1R染色强度(n= 50)评分从0到3。绘制dcSSc患者MC1R评分及mRSS,并测定其决定系数(R2)计算。所有值都表示为单独的绘图点。
附加文件4:表s1。
血清蛋白分析中测定的蛋白质列表。
附加文件5:表s2。
MT-7117处理的blm诱导SSc模型的微阵列基因表达谱。
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近藤,M.,铃木,T.,河野,Y.。et al。Dersimelagon,一种新的口服黑素皮质激素1受体激动剂,在系统性硬化症的临床前模型中显示了疾病改善作用。关节炎Res其他24210(2022)。https://doi.org/10.1186/s13075-022-02899-3
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关键字
- 系统性硬化病
- 肾上腺皮质受体
- 纤维母细胞
- 炎症
- 血管功能障碍
- 纤维化