基线IgG-Fc n -糖基化谱与早期炎症性关节炎患者队列的长期预后相关

背景

类风湿性关节炎(RA)是一种慢性自身免疫性疾病，从疾病开始的长期预后预测在临床上是不可行的。免疫球蛋白G (IgG)及其Fc的重要性N-糖基化在炎症中是众所周知的，研究描述了它与几种自身免疫疾病的相关性，包括风湿性关节炎。在此我们评估了IgG之间的联系N-早期炎症性关节炎队列2年的糖型和疾病预后。

方法

118例早期炎症性关节炎患者(naïve)的血清用于获得IgG Fc糖肽，然后用液相色谱-质谱联用(LC-MS)进行亚类特异性分析。对患者进行前瞻性随访，在使用传统合成dmard和从未使用生物dmard治疗的情况下，采用缓解或疾病活动度低(DAS28 < 3.2)和功能正常(HAQ≤0.25)的联合指标评估患者2年预后良好。

结果

我们观察到高水平IgG2/3 Fc半乳糖化之间的显著相关性(效应0.627，调整后)p完全半乳糖化的糖型H5N4F1值为0.036;效果−0.551，调整p无乳乳糖基化H3N4F1值为0.04963)，治疗2年后预后良好。在多变量分析中加入IgG糖谱分析来预测预后(模型中包括HAQ、DAS28、RF和ACPA)并没有改善模型的预后性能。

结论

在更大的队列中证实这些发现之前，IgG糖基化水平可作为早期关节炎的预后标志物，以克服当前预后工具的局限性。

类风湿性关节炎(RA)是一种常见的全身自身免疫性疾病，主要导致慢性关节炎症和功能限制[1］．在了解疾病的发病机制方面已经取得了重大进展，揭示了破坏疾病起始和进展的免疫耐受的几个遗传位点、表观遗传机制和环境因素[2］．对翻译后修饰蛋白[瓜氨酸化(acpa)，氨甲酰化(抗鲤鱼抗体)]以及识别免疫球蛋白G (IgG) Fc片段的类风湿因子(rf)的发展的自身免疫在疾病的临床前阶段开始[3.，4］．许多未知的机制促成了临床明显滑膜炎的进展，这是患者首次出现在临床的阶段[5］．医生第一次评估炎症性关节炎患者时必须做出诊断并评估预后。RA的诊断仍然主要基于临床数据，而RA特异性自身抗体和急性期反应物等实验室检测有助于诊断[6］．尽管自身抗体(rf和acpa)可在疾病出现前数年就存在[7]，它们作为诊断工具具有局限性，因为健康人也可能主要发展为RF，而最近的流行病学研究表明RF和ACPA血清阴性RA的发病率增加(高达50%)[8，9］．有趣的是，不符合类风湿关节炎分类标准但患有炎症性关节炎且无其他系统性自身免疫性疾病证据的患者被归类为未分化性关节炎(UA)并进行相应治疗[10］．第二个挑战是评估早期RA患者的预后。大多数基于临床、血清学和基线放射学数据的研究显示，RF或acpa的存在、骨侵蚀的存在以及急性期反应物的增加预示着更严重的疾病[11］．然而，目前提出的预测关节损伤或治疗反应的模型的准确性有局限性[12，13］．因此，需要新的诊断和预后生物标志物。根据这一概念，最近有数据支持单细胞水平的高通量分子数据作为疾病预后工具的价值[14，15］．

IgG同型的RF和ACPA属于糖蛋白家族。它们的片段可结晶区(Fc)以及很少的抗原结合区(Fab)是已知的N糖基化的。的N-糖基化结构对抗体的效应子和抗原结合功能至关重要，并被证明取决于不同的因素，如遗传学、表观遗传学、衰老和病理状态[16，17，18］．血清总IgG的研究N- RA患者的糖基化表现出较低的半乳糖基化，这与疾病活动性相关，但也预测了患者对治疗的反应，并在疾病发病前长达数年[19，20.，21，22，23，24］．此外，抗原特异性igg的糖基化，如ACPA，被证明在Fc和Fab区与总igg不同，从而影响其功能活性[25，26，27］．这强调了IgG糖基化在RA发病机制中的重要性。有趣的是，小鼠研究表明，在实验性关节炎前体期，在生发中心积累的il -23激活的TH17细胞可以改变IgGs的糖基化谱，使其朝向促炎自身抗体库，并触发实验性关节炎的发作[28］．此前Lundström等人的一项小型研究揭示了风湿性关节炎早期IgG-Fc半乳糖基化的变化及其对治疗反应的可能预测能力[29］．

在本研究中，我们评估了血清总IgG Fc的价值N-糖基化作为早期关节炎患者的诊断和预后生物标志物。我们应用了最先进的液相色谱-质谱(LC-MS)为基础的工作流程来分析亚类特异性IgG FcN-糖基化在118例早期、naïve例治疗、炎症性关节炎患者的血清中发现。患者在基线时进行横断面采样，并前瞻性随访2年。RA或UA的诊断基于既定的分类标准，同时在2年的随访中评估疾病的长期预后。

材料

甲酸(FA)购自默克公司(达姆施塔特，德国)。碳酸氢铵(ABC)从Acros有机物公司(Pittsburgh, PA, USA)获得。三氟乙酸(TFA)来自Sigma-Aldrich (St Louis, MI, USA)。LC-MS级乙腈(ACN)购自霍尼韦尔(Morris Plains, NJ, USA)。测序级胰蛋白酶来自Promega (Fitchburg, WI, USA)。

病人cohort-outcomes

美国哈拉里翁大学医院的“早期关节炎临床”是一项前瞻性的炎症性关节炎患者队列研究，Fanouriakis等人此前对其细节进行了描述。[13］．简单地说，对患者进行基线评估和定期间隔评估，为期2年。对于目前的研究，我们选择了一组患者naïve，接受任何免疫抑制治疗，在基线评估时可用血清(n= 118)。在基线时，也记录了人口统计学、RA临床特征[通过28个关节计数(DAS28)评估疾病活度，通过“健康评估问卷(aq - di)”评估功能]和实验室检测[自身抗体(RF和/或ACPA)](表1)．前瞻性随访患者2年，记录临床、实验室和疾病相关治疗。治疗决定是由治疗风湿病的医生根据国家指南做出的，而没有遵循严格的针对目标的治疗方案。该研究得到了克里特岛赫里翁大学医院机构审查委员会的批准(决定号:1476/20-03-2012)，所有患者都提供了参与研究的书面知情同意。

关于本分析的结果，基于既定标准，在基线评估或随访过程中对RA或UA进行了诊断[6］．此外，为了评估长期结果(2年)，为了克服数据缺失的限制，我们制定了3个具有临床意义的复合长期结果(表2):(2)在使用常规合成DMARDs (csDMARDs)(羟氯喹(HCQ)除外)或开始使用bDMARDs(不良结果2)时，在随访期间的任何时间开始使用生物疾病修饰抗风湿药物(bDMARD)(不良结果1)，2年时出现高疾病活度(HDA)(基于DAS28 > 5.1)或功能受损(基于HAQ > 1.0)，(3)在使用csDMARDs且从不使用bDMARDs治疗时，缓解或疾病活动度低(基于DAS28 < 3.2)和功能正常(基于HAQ≤0.25)(结果良好)。

在IgG分离之前，样本和内部血清标准随机放入两个96孔板中。

免疫球蛋白隔离

如puiich等人先前所述，使用96孔蛋白G整体板(BIA分离，ajdovovic，斯洛文尼亚)通过亲和层析法从血清中捕获igg。[30.］．简单地说，100 μL血清用700 μL 1X磷酸缓冲盐水(PBS)稀释，通过0.45μm GHP滤板(Pall公司，Ann Arbor, MI, USA)过滤。然后将样品装入蛋白G板上，用2ml 1X PBS洗涤三次。IgGs用1 mL 0.1 M FA洗脱，170 μL 1 M ABC中和。使用NanoDrop 8000分光光度计(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)测量蛋白质浓度。

IgG消化纯化

分离后，用0.18 μg测序级胰蛋白酶在37°C下消化分离的IgGs(范围为7.44 ~ 46 μg)。用Chromabond C18珠(machery - nagel, Düren, Germany)反相固相萃取(RP-SPE)清除胰蛋白酶消化。简而言之，样品用0.1%的TFA稀释10倍，装在珠子上，然后用0.1%的TFA洗涤3次。糖肽用20% ACN从珠子中洗脱，真空离心干燥。

IgG-Fc糖肽的RPLC-MS分析

将所得的糖肽在20 μL超纯水中重组，然后用反相液相色谱(RPLC) -质谱(MS)联用分析。LC分离采用nanoAcquity UPLC系统(Waters, Milford, MA, USA)与四极飞行时间(q-TOF) MS仪器(Compact, Bruker, Bremen, Germany)耦合，使用Bruker的CaptiveSpray电喷雾电离(ESI)源。使用C18分析柱(150 mm x 100 μm ID, 100 Å， Advanced Materials Technology, Wilmington, DE, USA)进行分离，柱室设置为30°C。样品(10 μL)首先加载在C8捕集柱(PepMap 100, 5 mm × 300 μm ID, Thermo Fisher Scientific)上，流速为15 μL/min。流动相为:溶剂A为0.1% TFA，溶剂B为80% ACN，溶剂B为0.1% TFA，流速为1 μL/min，时间为8 min，梯度为溶剂B的18% ~ 28%。

质谱仪工作在正离子模式，电喷雾电压设置为1.5 kV。ESI源与CaptiveSpray纳米助燃器一起使用，在0.2 bar的压力下添加富集氮与ACN结合，并在150°C下添加4 L/min的氮气干燥气体。四极子碰撞电池能量为5 eV。质谱记录在am / z800 - 2000的范围。

LC-MS数据使用先前描述的特定软件(LacyTools版本1.1.0)进行处理[31]，并进行了较小的更改，例如将需要对齐的最小特征设置为5，数据点数设置为33。为了比较不同样品的测量结果并计算每种IgG亚型的相对丰度，采用以下归一化方法。首先，对每个糖肽的同位素模式进行校正，方法是将2+和3+电荷状态下的强度相加，然后除以软件发现的同位素模式的分数。然后，用校正后的总和除以每个峰的总强度计算每个糖肽的相对丰度。相对丰度用总归一化强度的%表示，并表示给定糖肽在单个亚类中记录的所有糖肽的总和中的相对丰度。这种处理产生了16个IgG1, 9个IgG2/3的相对丰度数据，它们共享相同的胰蛋白酶肽序列，和10个IgG4 FcN-糖型可供每个样品。

通过计算7种血清标准中每个IgG亚类的所有糖型的平均相对丰度、标准差(SD)和变异系数(CV)来评估该方法的稳健性。中位cv为IgG1的3.74%，IgG2/3的4.88%，IgG4的4.10%(补充表1)．

统计分析

亚类特异性IgG FcN-糖谱分析通过一般线性模型(ANCOVA)进行统计分析，并根据年龄、性别和症状持续时间进行校正。在分析之前，通过秩到正态的反变换(R包“GenABEL”，函数rntransform)，将糖基变量全部转化为标准正态分布(均值= 0,SD = 1)。在分析中使用秩转换变量可以使不同聚糖的估计效果具有可比性，因为转换后的聚糖变量具有相同的标准化方差。伪率发现采用Benjamini-Hochberg过程控制。由于igg在每个亚类中所显示的糖型数量不同，且样本量较小，使多重检测负担过大，因此仅使用最丰富的4个物种进行统计分析。这些物种H3N4F1, H4N4F1, H5N4F1和H5N4F1S1可以用它们的己糖(H)的数量来描述，N-乙酰氨基葡萄糖(N)、病灶(F)和唾液酸残基(S)。根据诊断，将患者分为两组，类风湿关节炎(RA，组1,60%的患者)或未分化关节炎(UA，组2,40%的患者)。根据2年后的临床特征，测试了3种不同的长期结果，2种不良结果和1种有利结果(表2)．

缺乏与诊断相关的IgG糖基化谱

采用lc - ms工作流程研究亚类特异性IgG FcN-糖基化对118例早期炎症性关节炎患者进行了研究。LC条件导致从IgG1 (EEQYNSTYR)、IgG2/3 (EEQFNSTFR)和IgG4 (EEQFNSTYR)中分离糖肽(见补充图)。1)．从LC-MS数据中获得了所有糖型的相对丰度(补充图。2)，然后使用LaCyTools软件进行处理。使用IgG1、2/3和4中最丰富的四种糖型的相对丰度进行统计分析。

首先，我们观察了RA和UA这两个诊断组之间最丰富的4种糖型(H3N4F1, H4N4F1, H5N4F1，和H5N4F1S1)相对丰度的差异(图1)。1)．即使诊断为早期未分化关节炎的患者(组2)具有较高的半乳糖化和唾液化的相对丰度N-糖型(H4N4F1, H5N4F1，和H5N4F1S1)与类风湿性关节炎患者(组1)比较，差异均未达到显著性阈值(补充表)2)．

IgG糖基化谱可预测长期预后

由于两个诊断组在糖基化谱上无统计学差异，因此将其分组，以便进一步分析IgG之间的相关性N-糖型和疾病转归定义在三个不同的组中(不良转归1和2，有利转归;表格2)．分析显示IgG2/3和Fc之间存在显著的相关性N-描述半乳糖基化水平(H3N4F1和H5N4F1)和“良好结果”(定义为DAS28 < 3.2, HAQ≤0.25,2年无bDMARD治疗)的糖型(补充表)3.)．治疗前半乳糖基化程度较高(H5N4F1的丰度较高)，因此治疗前IgG2/3的半乳糖基化程度较低(H3N4F1的丰度较低)的患者在2年治疗后预后良好(图。2)．同一亚类(IgG2/3 / H5N1F1S1)的唾液酰化以及IgG1和IgG4的半乳糖基化和唾液酰化似乎遵循相同的趋势，但调整后的p值不显著(补充表)3.)．有趣的是，当我们分析基线糖基化水平与个别参数(即24个月时的DAS28, 24个月时的HAQ，使用过的生物制剂)时，除了IgG1 (H5N4F1S1)与基线和24个月间HAQ差异之间的关联趋势(pdisorderly = 0.087)。

接下来，我们检查了基线时临床特征之间的相关性，如血清阳性(即RF和/或抗ccp抗体的存在)、DAS28(低< 3.2 vs中-高≥3.2)HAQ(轻-中度功能受损< 1 vs重度残疾≥1)和2年后的预后。虽然HAQ与“不良结果1”和“2”相关，但DAS28与“良好结果”相关(补充表4)．也检测了IgG亚类的糖型与基线临床特征、急性期反应物和自身抗体水平(RF和ACPA水平)之间的相关性，但没有显示出任何统计学上显著的相关性(补充表)5)．最后，在预测预后的多变量分析中(模型中包括HAQ、DAS28、RF和ACPA)， IgG糖谱分析的加入并没有改善模型的预后性能(数据未显示)。

在本研究中，我们应用了一种经过验证的高通量亚类特异性IgG FcN-糖基化LC-MS谱分析方法，评价IgG糖基化状态作为早期炎症性关节炎患者的诊断和预后工具[32］．此外，在样品处理和数据分析方面，也对该方法进行了优化，使批量效应和大量样品分析过程中可能发生的其他影响最小化。这种最先进的方法已被广泛认为是分析IgG糖基化的强大诊断工具[33，34］．因此，在对几种糖型进行量化后，对可能影响IgG糖基化的基线因素(症状持续时间、年龄和性别)进行校正，我们发现糖基化谱与2年预后相关[30.，35］．值得注意的是，本研究中使用的血清样本来自treatment-naïve例患者;因此，IgG糖基化的变化并不代表任何治疗效果，而可能反映炎症的影响。

约50-70%的早期关节炎患者发展为风湿性关节炎，30-40%的患者被诊断为UA [36］．因此，在评估早期炎症性关节炎患者时，第一个临床挑战是建立诊断。因此，我们旨在评估IgG之间的相关性N-糖基化和两个诊断组。初步统计分析未发现UA和RA患者之间IgG糖基化有显著差异。这并不是一个意外的发现，因为有数据支持炎性关节炎中免疫球蛋白的糖基化水平降低，而不考虑具体的诊断(风湿性关节炎或脊椎炎)。此外，尽管没有数据比较不同关节炎之间的糖基化水平，但已有研究表明，TNF抑制剂的有效治疗增加了类风湿关节炎和脊椎炎的IgG糖基化水平[37］．因此，我们的数据证实了上述数据，支持糖基化水平主要受炎症负担的影响，而疾病特异性机制不是重要的因素。

如前所述，对于早期炎症性关节炎(无论是风湿性关节炎还是风湿性关节炎)的患者，第二个挑战是预测其长期预后。为了解决这一问题，我们基于24个月时的疾病活动/功能和2年期间的药物使用，建立了3个临床重要性的主要结果。我们使用了临床重要参数的组合，因为生物制剂的使用相当低(16.9%(20/118))，而且最重要的是，在临床实践中，由于各种原因(患者和医生相关)，治疗决策并不严格基于疾病活动水平[38，39，40］．因此，正如在几个早期关节炎队列中所显示的，35-55%的早期关节炎患者没有根据治疗-靶向原则使用bdmard治疗，我们认为有一个“组合”结果是有效的，包括bdmard治疗和高疾病活度/功能受损。分析显示，通过将两个诊断组分开，IgG糖型与不良或有利结果之间没有统计学上的显著关联。然而，通过将这两组合并在一起，从而增加统计效力，在高水平的双半乳糖基化IgG糖型和2年治疗后的良好预后之间显示出显著的关联。这些结果与以往关于异常IgG的研究一致N-糖基化在类风湿性关节炎患者中的作用已被多次报道[22，23，24］．低水平的IgG半乳糖基化被证明与疾病活动和症状严重程度相关，甚至在疾病发展之前[17，41］．尽管如此，我们的研究首次显示了IgGs糖基化谱与长期预后之间的关系。我们研究中的少量患者可以解释为什么只有IgG2/3亚型表达这种典型的无乳乳糖基化水平，因为我们预期IgG1也有同样的趋势。其他可能的原因可能是不同IgG亚型Fc糖基化谱的细微差异。因此，我们发现与其他亚类相比，IgG2/3的半乳糖基化和唾液基化更低，证实了之前研究的观察结果[42，43］．Fc糖基化的这些差异反映在它们与Fcγ受体(Fcγ r)的结合亲和力和调节效应子功能的能力[44］．文献显示，IgG2对FcγRs的亲和力最低，ADCC容量最低，而IgG3则相反[44，45，46］．不幸的是，所使用的糖谱分析方法不允许单独识别IgG2和IgG3 Fc糖型，从而阻碍了对它们与疾病结局的明显关联的评估。

有趣的是，在我们的队列中，患者的功能价值(HAQ状态)再次与长期预后相关。然而，在多变量分析中，糖基化状态不能预测2年的预后。

我们研究的一个局限性是我们没有可能评估自身免疫疾病中IgG糖基化改变的生物学意义。对于自身抗体阳性(ACPA或RF)的RA尤其如此。然而，已发表的文献表明，IgG-Fc糖基化水平的潜在机制有助于免疫反应。因此，研究表明，插入重链之间的两个Fc-linked碳水化合物对抗体的三维结构和生物活性至关重要[47］．数据表明，由于非糖基化分子无法与Fcγ r结合，Fc聚糖的去除会降低IgG Fc介导的生物活性[48］．此外，某些修饰会影响igg介导的抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC) [49]，而fc链接的聚糖调节补体级联的激活[50］．最后，研究表明，高度半乳糖化的IgG1免疫复合物(ICs)、抑制性IgG受体fc - γ RIIB和c型凝集素样受体dectin-1抑制C5a受体(C5aR)的功能和相应的C5a依赖性炎症反应[51］．上述机制在类风湿关节炎中是否重要，或是否影响类风湿关节炎特异性自身抗体的功能，目前尚不清楚。值得注意的是，在类风湿关节炎患者中，已观察到异常IgG半乳糖化水平与疾病活动性之间的显著相关性，并证实了其在类风湿关节炎炎症反应中可能起作用[52］．

本研究的另一个局限性是在随访期间缺乏患者的连续采样。有人可能会说，这些补充信息可能对IgG的基线特征具有附加价值N-糖基化状态，作为疾病转归的预测因子。然而，由于在治疗过程中(感染、衰老、治疗效果等)不能排除其他因素的潜在贡献，分析将会更加复杂。事实上，总(非抗原特异性)IgG糖基化的改变与各种生理和病理状态有关，因为它们似乎对一般的炎症能力有反应。

总之，我们发现了IgG2/3 FcN-在随访2年的早期关节炎患者中，糖型与良好的预后相关(疾病活动度低或缓解，功能保留，无需bDMARD治疗)。如果目前的数据在更大的队列中得到证实，可能具有临床价值。由于目前可用的预后工具有很大的局限性，进一步的研究应旨在开发一种基于临床、血清学数据和新型生物标志物的高特异性和敏感性的预测工具。

支持本文研究的原始数据将由作者提供，没有多余的保留。

美国广播公司(ABC):

碳酸氢铵

雨:

乙腈

ACPA:

Anti-citrullinated肽抗体

bDMARD:

生物治病抗风湿药

中国共产党:

循环citrullinated肽

csDMARD:

传统合成的改善疾病的抗风湿药物

简历:

变异系数

DAS28:

疾病活动得分

应急服务国际公司:

电喷雾电离

工厂:

片段antigen-binding

舰队指挥官:

片段可结晶的

费尔南多-阿隆索:

甲酸

有:

高疾病活动

哈克:

健康评估问卷

HCQ:

羟氯喹

免疫球蛋白:

免疫球蛋白G

质:

液相色谱-光谱法

PBS:

磷酸盐

类风湿性关节炎:

类风湿性关节炎

射频:

类风湿因子

SD:

标准偏差

组织:

三氟乙酸

UA:

未分化的关节炎

没有一个

该研究由GlySign和SYSCID -欧盟的地平线2020研究和创新项目资助，资助号分别为722095和733100。

作者和联系

1. 蛋白质组学和代谢组学中心，莱顿大学医学中心，2300 RC，莱顿，荷兰

   托马斯Senard

2. 风湿学和临床免疫学，赫拉里翁大学医院，71003，希腊

   Irini Flouri, George Bertsias & Prodromos Sidiropoulos

3. Genos糖科学研究实验室，萨格勒布，克罗地亚

   弗朗诺·沃伊夫科维奇，马娅·普维奇-巴科维奇，玛丽娅·佩泽和戈尔丹·劳克

4. 克里特岛大学医学院风湿病、自身免疫和炎症实验室，希腊赫拉克里翁71305

   Garyfalia Papadaki, Panagiota Goutakoli, George Bertsias & Prodromos Sidiropoulos

5. 雅典学院生物医学研究基金会炎症和自身免疫实验室，11527，希腊雅典

   Aggelos Banos

6. 萨格勒布大学药学和生物化学学院，克罗地亚萨格勒布

   云Lauc

贡献

p.s.， M.P和G.L.设计了这项研究。a。b。p。g。和g。p。采集了血清样本。T.S. M.P-B。进行糖肽分析。F.V.进行了统计分析。M.P-B见fvsl, t。，M.P., and I.F. interpreted the data. T.S. wrote the original draft of the manuscript. M.P-B., M.P., F.V., P.S., and G.B. reviewed and edited the manuscript. All authors have read and agreed to the published version of the manuscript.

相应的作者

对应到云Lauc．

伦理批准和同意参与

该研究得到了克里特岛赫里翁大学医院机构审查委员会的批准(决定号:1476/20-03-2012)，所有患者都提供了参与研究的书面知情同意。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

G.L.是Genos有限公司的创始人和所有者，Genos是一家私人研究机构，专门从事高通量的聚糖分析，并在该领域拥有多项专利。见fvsl M.P-B。，而且M.P. are employees of Genos Ltd. All other authors declare no conflict of interest.

出版商的注意

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