T细胞和B细胞在PBMC诱导人源性SSc小鼠模型的建立中都是必不可少的

背景

近年来，通过移植系统性硬化症(SSc)患者外周血单核细胞(PBMC)建立了一种新的人源化小鼠模型Rag2^−−/Il2rg^−−/免疫缺陷小鼠。在这里，我们旨在研究T细胞和B细胞在人源化小鼠模型中的作用。

方法

利用抗cd3和抗cd19磁场，从体外分离的PBMC中清除T细胞和B细胞微,分别。随后，将PBMC和T细胞或B细胞耗尽的PBMC转入Rag2^−−// Il2rg^−−/小鼠通过腹腔注射。移植后12周，处死小鼠进行评估。

结果

从SSc患者身上移植全PBMC的小鼠出现了肺部、肾脏和肝脏的全身性炎症，在实验过程中，11只小鼠中有6只死亡或不得不被处死。相比之下，在转移了相应的T细胞或B细胞耗尽的PBMC的小鼠中没有观察到这种炎症和死亡。与这一发现相一致的是，全PBMC移植恢复了由人T、B和浆细胞组成的脾白髓，并导致受体小鼠产生大量的人自身抗体，而这些免疫学特征在接受T或B细胞耗尽的PBMC的小鼠中很少观察到。与我们之前的研究结果显示B细胞治疗的保护作用转移到小鼠相比，用化学免疫抑制药物治疗SSc患者并不影响PBMC的致病性。

结论

本研究表明，T细胞和B细胞在PBMC转移诱导的SSc小鼠模型的发病机制中都是必不可少的。

系统性硬化症(SSc)是一种严重的结缔组织疾病，以自身免疫、炎症、血管病变和纤维化为特征[1］．SSc除了累及皮肤外，还常累及其他许多内脏器官。组织学研究表明，这种淋巴细胞浸润存在于SSc发展的早期阶段，早于纤维化发生[2，3.］．动物模型，尤其是小鼠模型，是帮助我们了解疾病发病机制的有力研究工具[4］．到目前为止，已经建立了20多个SSc小鼠模型，它们为理解该疾病的发病机制提供了新的见解[5］．然而，小鼠和人类在许多方面的差异，尤其是在免疫系统方面，限制了从实验到临床的转化[6］．克服这一障碍的一个策略是使用人性化的老鼠模型[7］．最近，我们通过将SSc患者的外周血单个核细胞(pmbc)转移到免疫缺陷小鼠，建立了一种人源化的SSc小鼠模型[8］．在转移SSc患者的PMBC后，小鼠产生了几种SSc相关的自身抗体(abs)，包括抗核抗体(ANA)以及抗血管紧张素- ii型1受体(AT1R)和抗内皮素-1型A受体(ETAR) abs。此外，小鼠出现了肺、肾、肝和肌肉的淋巴细胞浸润，模拟了SSc的系统性炎症。相反，在接受从健康受试者或肉芽肿多血管炎患者分离的PBMC的小鼠中，很少观察到腹肌和全身炎症[8］．

PBMC移植诱导的人源化小鼠模型除了弥合小鼠与人之间的差距外，至少还有两个优势。一方面，PBMC在转移之前可以在体外进行有目的的处理，这可以确定候选分子或细胞的作用。另一方面，SSc患者PBMC来源的异质性也为研究患者相关因素对疾病表现的影响提供了机会。例如，我们之前的研究表明，从SSc患者身上移植PBMC的小鼠，这些小鼠接受了利妥昔单抗(一种消耗B细胞的单克隆抗体)治疗，既不会产生abs，也不会发生系统性炎症[8]，提示B细胞在疾病发病机制中起重要作用。本研究旨在探讨人T细胞和B细胞在人源化小鼠模型中的作用。为此，我们从疾病发展、死亡率和受体动物的淋巴器官结构等方面分析了SSc患者在转移到免疫缺陷小鼠之前PBMC中的B或T细胞缺失的影响。基于观察到的T细胞和B细胞的关键作用，我们对我们以前和现在关于免疫抑制药物对疾病转移病理的影响的数据进行了回顾性分析。

病人

共有11例SSc患者入选了德国Lübeck大学风湿病学系。患者使用2013年ACR/EULAR SSc分类标准进行诊断[9］．鉴于我们之前的研究表明，从接受利妥昔单抗治疗的患者身上转移PBMC不能诱导受体小鼠发病[8]，在本研究中，我们试图排除接受强免疫抑制药物的患者，包括霉酚酸酯、环磷酰胺或其联合用药。所有患者均通过书面知情同意书同意本研究。因为我们(8和其他[10，11，12]已经令人信服地证明了从健康受试者转移的PBMC不能诱导受体小鼠产生自身抗体或组织炎症，在目前的研究中，我们没有招募健康志愿者。本研究根据1964年赫尔辛基宣言进行，并获得Lübeck大学制度伦理委员会的批准(编号:16-199，日期:2016/11/14)。

老鼠

女性B10; B6 -Rag2^tm1FwaIl2rg^tm1Wjl（Rag2^−−/Il2rg^−−/)小鼠均购自美国Taconic Biosciences公司。这些小鼠被安置在Borstel研究中心的动物设施中，在特定的无病原体条件下，光照/黑暗周期为12小时。所有动物研究均由德国基尔能源变化、农业、环境、自然和数字化部动物研究伦理委员会批准(编号:V 241 - 50577/2017(108-8/17)，日期:2017.05.10)。

人PBMC的分离和T细胞或B细胞的缺失

使用密度梯度培养基Pancoll从外周血中分离人PBMC，如前所述[8］．耗尽T细胞或B细胞，2 × 10⁷分别用抗人CD3微珠(Miltenyibiotec)和抗人CD19微珠(Miltenyibiotec)孵育人PBMC，使用AutoMACS程序。对应的整个PBMC控制样品为2 × 10⁷没有用微珠孵育的人PBMC通过了AutoMACS程序。将洗脱后的PBMC离心、洗涤，再用100 μl RPMI 1640培养基重悬。

PBMC过继转移

Rag2^−−/Il2rg^−−/实验用的是8 ~ 10周龄的雌性小鼠。然后是2 × 10⁷PBMC通过AutoMACS程序，在100 μl RPMI 1640培养基中重悬，并腹腔注射到每只受体小鼠。从患者身上接受全PBMC、T细胞缺失PBMC或B细胞缺失PBMC的小鼠作为配对组进行比较。

流式细胞术

B细胞的频率，CD4⁺T细胞和CD8⁺通过流式细胞术检测人PBMC中的T细胞，如前所述[8］．简单地说，用抗人CD3-BV421 (BD Biosciences，克隆UCHT1)、抗人CD4-BV650 (BD Biosciences，克隆2RPA-T4)、抗人CD8-APC (BD Biosciences，克隆SK1)、抗人CD20-Percp/cy5.5 (BD Biosciences，克隆2H7)和抗人CD45-FITC (BD Biosciences，克隆2D1)染色，并使用LSR II流式细胞仪(BD，美国)进行检测。使用FACS Express软件(De Novo software, USA, version 5)对数据进行分析。

酶联免疫吸附试验(ELISA)

用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定人总IgG、人抗at1r和抗etar抗体的水平，采用前面描述的方法[8］．如前所述，使用定量ELISA法测定人总IgG [8］．

组织学

取小鼠皮肤、肺、肝、肾、肌肉、脾脏等脏器，4%多聚甲醛固定24 h，脱水石蜡包埋，4 μm厚切片进行组织学分析。4 μm石蜡包埋切片用苏木精和伊红染色(H&E)进行组织学评价。炎症严重程度定义为发生炎症面积的百分比(受累面积/总面积×100%)。

免疫组织化学染色(包含IHC)

小鼠脾脏石蜡切片进行免疫组化(IHC)染色，检测人CD4⁺T细胞,CD20⁺B细胞和CD138⁺浆细胞(5，7］．经抗原回收后，内源性过氧化物酶、内源性生物素和非特异性结合被3% H阻断₂O₂生物素阻断液(Vector Laboratories, Inc.)Burlingame, CA94010，美国)和5% BSA (Sigma，圣路易斯。美国MO)解决方案。随后，将切片与抗人CD4 (Abcam, UK，克隆:EPR6855)、人CD20 (Dako, Santa Clara, CA, USA, Clone: L26)或人CD138 (Biolegend, San Diego, CA, USA)的一抗在4°C孵育过夜。克隆:M15)，然后与生物素结合的山羊抗兔IgG孵育(Jackson免疫研究实验室)。或山羊抗小鼠IgG(杰克逊免疫研究实验室。美国巴尔的摩Inc .)。最后，使用3,3-二氨基苯扎丁(DAB底物试剂盒，Vector Laboratories, Inc.)对免疫反应进行可视化。切片用苏木精复染。

统计分析

数据分析使用GraphPad5 Prism软件(La Jolla, CA, USA)。正态分布的定量资料用平均值±标准差(mean±SD)表示，非正态分布的资料用中位数(min、max)表示。为评估定量资料差异的显著性，进行配对t当数值为正态分布时进行检验，当数值为非正态分布时进行Wilcoxon配对检验。采用Fisher精确检验法分析小鼠死亡率的差异。累积生存曲线采用Kaplan-Meier分析。由于分析的变量大多不是正态分布的，所以定量变量的评价采用Spearman相关分析。为了评价化学免疫抑制药物治疗对人源化小鼠模型PBMC致病性的影响，我们将SSc患者经各种化学免疫抑制药物治疗后的PBMC小鼠与未经任何免疫抑制药物治疗的PBMC小鼠进行比较。一个p值< 0.05为有统计学意义。

SSc患者的人口学和临床特征

本研究共纳入SSc患者11例(男3例，女8例)，lcSSc患者9例，dcSSc患者2例。这些患者的人口学和临床特征总结在补充表中1．SSc患者平均年龄57岁，中位病程5.1岁。11例患者中ANA阳性9例，抗scl70抗体阳性4例，ACA阳性4例。所有11名患者都患上了雷诺综合征，其中部分患者出现了肺部、肾脏、心脏和胃肠束。补充表1并总结了患者的治疗情况。

人体PBMC中T或B细胞的缺失

从11例SSc患者中分离到PBMC，台盼蓝排除试验表明PBMC细胞存活率超过90%。T细胞或B细胞耗尽后，用流式细胞仪(FACS)分析耗尽效率。如Suppl所示。无花果。1， T细胞的减少导致了人类CD3的显著下降⁺PBMC中的T细胞(65.7±11.9% ~ 10.2±11.9%)。对两种主要T细胞亚型的进一步评估表明，CD4⁺T细胞在所有样本中几乎完全耗尽(从39.3±10.9%到1.81±1.45%)，而CD8⁺T细胞只能部分清除(21.2±5.55% ~ 6.55±9.15%)。烧蚀B细胞效率高，完全缺乏CD20⁺B细胞分布在所有样品中(7.46±4.01% ~ 0.08±0.05%)。

然后是2 × 10⁷PBMC，无论T细胞或B细胞是否耗尽，均转入Rag2^−−// Il2rg^−−/注射老鼠。18只小鼠移植全PBMC (n= 6)， T细胞耗尽的PBMC (n= 6)，或B细胞耗尽的PBMC (n= 6) 6例SSc患者的可用细胞数。2只小鼠移植全PBMC (n= 1)或T细胞耗尽的PBMC (n= 1) 1例SSc患者。8只小鼠移植全PBMC (n= 4)或B细胞耗尽的PBMC (n= 4) 4例SSc患者。本实验共分为7组全PBMC vs T细胞耗竭的PBMC和10组全PBMC vs B细胞耗竭的PBMC。移植6周后，三组受体小鼠外周血均可检测到人白细胞。与接受完整PBMC的小鼠相比，接受T细胞耗竭PBMC的小鼠，而不是接受B细胞耗竭PBMC的小鼠，循环人类白细胞的水平显著降低(Suppl。无花果。2)．

T或B细胞的减少可抑制PBMC转移诱导的死亡

从SSc患者移植全PBMC的6只小鼠死亡或必须处死体重减少20%或更多的而在从SSc患者身上转移T细胞或B细胞耗尽的PBMC的小鼠中，没有观察到这样的死亡。Kaplan-Meier分析显示，整个pbmc转移组与耗尽T细胞的pbmc转移组、耗尽B细胞的pbmc转移组的累积生存期存在显著差异(图3)。1A).因此，全PBMC转染小鼠的死亡率明显高于T细胞或B细胞缺失PBMC转染小鼠(图1)。1B)。

之前，我们证明了从SSc患者身上移植PBMC可以恢复免疫缺陷小鼠的脾白髓[5］．接下来，我们确定了T细胞或B细胞减少对这种恢复的影响。果然，脾脏Rag2^−−/Il2R^−−/从SSc患者身上移植了完整PBMC的小鼠的特征是结构良好的白色牙髓(图)。2)．然而，在PBMC T细胞耗用小鼠的脾脏中(7只中0只)看不到这种结构良好的白髓，而在PBMC B细胞耗用小鼠的脾脏中(10只中2只，图。2)．

免疫组化染色观察人淋巴细胞在小鼠脾脏中的分布。如图所示。2从SSc患者移植完整PBMC的小鼠，其结构良好的脾白髓主要由人CD20组成⁺B细胞和CD4⁺T细胞以及少量的人类CD138⁺浆细胞。然而，很少CD4⁺T细胞,CD20⁺B细胞或CD138⁺转染T细胞缺失PBMC小鼠的脾脏均能检测到浆细胞。B细胞耗尽的PBMC转染小鼠，CD4细胞数量较少⁺T细胞，但不是CD20⁺B细胞和CD138⁺不含白髓的脾脏可见浆细胞(图1)。2)，在具有白色髓样结构的小鼠脾脏中可以检测到许多T细胞，但没有B细胞或浆细胞(数据未显示)。

T或B细胞的减少会减少人IgG和自身抗体的产生

考虑到T或B细胞的减少会影响白髓的恢复，以及人血浆细胞在小鼠脾脏中的存在，我们下一步确定了小鼠血清中的人IgG和抗体。实验结束前死亡或必须处死的6只小鼠，其中5只在死亡时采集血清样本，1只未采集血清样本。所有其他小鼠的血清在移植后第12周制备。如图所示。3.A, B，从SSc患者转移整个PBMC的小鼠产生了相当数量的人IgG。与转染全PBMC的小鼠相比，两种小鼠均转染了无T细胞PBMC (p= 0.031)和小鼠转染B细胞耗尽的PBMC (p= 0.004)产生的人类IgG显著减少。此外，我们还测定了抗at1r IgG和抗etar IgG的水平，它们已被证明与SSc的易感性、严重程度和死亡率相关[13，14，15］．从SSc患者转染全PBMC的小鼠产生了抗at1r和抗etar IgG抗体，而在转染T细胞和B细胞耗尽的PBMC的小鼠中均未检测到这两种抗体。3.氟)。根据我们之前的研究，大约30%接受SSc患者PBMC的小鼠产生了抗核抗体(ANA)， ANA模式与相应的SSc供体中观察到的一致[8］．接下来，我们确定T细胞或B细胞的减少是否会影响受体小鼠ANA的产生。7只移植了患者源性PBMC的小鼠中有2只血清中检测到ANA。而且，与以往的结果一致，两种阳性血清的ANA模式与两种相应患者的ANA模式一致。相比之下，从2例SSc患者中分离的小鼠接受了T细胞或B细胞减少的PBMC，其ANA评分为阴性(Suppl。无花果。3.)．

人PBMC移植后受体小鼠的组织炎症

为了评估人T细胞和B细胞在疾病表现中的作用，我们对小鼠肺、肾、肝、心脏、肌肉、肠道、食管和皮肤等组织进行了组织病理学评估。虽然接受SSc患者完整PBMC的6只小鼠在实验结束前死亡或被处死，但所有小鼠的组织都被收集并分析。

从SSc患者身上移植全PBMC的小鼠出现了肺部、肾脏和肝脏炎症。4)，而不是在心脏、肌肉、肠道、食道或皮肤中(数据未显示)。然而，用T细胞耗竭的PBMC或B细胞耗竭的PBMC移植的小鼠的肺、肾和肝脏中很少或没有炎症(图。4)．因此，这些结果表明，在这个人源化的SSc小鼠模型中，T细胞和B细胞都是需要的。

为了明确组织炎症、循环人类白细胞和小鼠外周血抗体之间的关系，我们对10只接受完整PBMC的小鼠进行了相关性分析。肺部、肾脏和肝脏炎症的严重程度，以及循环中的人类CD45水平⁺白细胞,CD3⁺T细胞CD4⁺CD8 T细胞,⁺T细胞和CD20⁺细胞转移后第6周的B细胞，小鼠牺牲后血清中总IgG、抗at1r IgG、抗etar IgG水平均纳入分析。如图补充图所示。4，肺炎症与循环的人CD20水平显著相关⁺B细胞，抗at1r IgG，抗etar IgG。

患者免疫抑制药物对小鼠PBMC转移性疾病表现的影响

广泛用于SSc治疗的化学免疫抑制药物被怀疑影响淋巴细胞[16考虑到人T细胞和B细胞在这个人源化小鼠模型中不可或缺的作用，我们下一步研究使用这类药物治疗患者是否会影响受体小鼠PBMC转移诱导的疾病表现。为此目的，我们对当前研究和之前研究的数据进行了分析[8］．7例SSc患者经霉酚酸酯、泼尼松龙、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、环孢素等多种免疫抑制药物治疗后的PBMC转移至9只受体小鼠，9例SSc患者未经任何免疫抑制药物治疗的PBMC转移至10只受体小鼠(补充表)2)．我们首先评估了CD3的百分比⁺, CD4⁺, CD8⁺T细胞和CD20⁺从SSc患者分离的PBMC中的B细胞。如图所示。5A，虽然接受免疫抑制药物治疗的患者PBMC中上述4个亚群的淋巴细胞均值均略低于未接受免疫抑制药物治疗的患者，但差异无统计学意义。

在移植后，接受免疫抑制药物治疗的患者的PBMC的小鼠与未接受免疫抑制药物治疗的患者的PBMC的小鼠在肺和肾脏中显示出相似的炎症水平。5此外，两组小鼠产生的人类IgG水平相当(图。5D)患者PBMC移植后12周内，免疫抑制组9只小鼠中有4只死亡或需要处死，免疫抑制组10只小鼠中有6只死亡或需要处死。两组患者的死亡率差异无统计学意义(图。5E、F)。

在本研究中，我们研究了人T细胞和B细胞在人源性SSc小鼠模型中的作用，在该模型中，疾病特征是通过患者来源的PBMC过继转移到Rag2^−−/Il2rg^−−/老鼠。与我们之前的发现一致[8]，从SSc患者移植整个PBMC可以恢复结构良好的脾白髓，并诱导人IgG和SSc相关抗体的产生，以及受体小鼠发生系统性炎症。然而，当这些PBMC在移植前从体外耗尽T或B细胞时，受体小鼠没有显示任何这些免疫、组织病理学或临床特征。

通过在转移前体外耗尽B细胞，我们证实了B细胞在人源化小鼠模型中不可或缺的作用[8］．这些发现与B细胞活化与SSc的发生发展相关的临床观察结果一致[17，18］．此外，这一发现也为B细胞靶向治疗SSc患者提供了支持。目前，利妥昔单抗已被用于治疗SSc，尤其是弥漫性皮肤形态的SSc [19，20.，21，22，23]，并已证明利妥昔单抗耐受性良好，对皮肤硬化、关节受累和肺纤维化有有益作用[24，25］．作为抗体产生细胞，B淋巴细胞可能通过产生抗体来促进疾病表现的发展。除了自身抗体的产生，B细胞还能通过释放细胞因子和作为抗原提呈细胞参与SSc及其动物模型的疾病发展。例如，有人认为B细胞来源的IL-6有助于致密小鼠的疾病表现[26］．此外，B细胞可以作为APCs，从而影响T细胞的功能[27］．

生发中心(GCs)是次级淋巴器官的特殊区隔，对有效的适应性免疫反应的发展至关重要[28］．在本研究中，从SSc患者移植完整PBMC的免疫缺陷小鼠产生了由CD4 T细胞、B细胞和浆细胞组成的脾白髓，提示GCs的形成。相比之下，在接受了T细胞耗尽的PBMC的小鼠中没有观察到脾白髓。另外，虽然10只小鼠中有2只移植了人B细胞耗尽的PBMC，但脾脏中不含B细胞或浆细胞。因此，这两只小鼠没有产生腹肌，这表明这些白色的果肉状结构不包含有功能的gc。因此，这些结果支持了T细胞和B细胞对于功能性GCs的形成都是不可或缺的，这与B细胞和T细胞都是GCs的基本组成部分的观点一致[29］．这些发现也表明T细胞和B细胞之间的相互作用在GC的形成中起着重要的作用，进一步研究这一过程的调控将是有趣的。

有趣的是，从SSc患者转移整个PBMC的受体小鼠产生了针对AT1R和ETAR的自身抗体，而转移B细胞或T细胞耗尽的PBMC的小鼠无法产生这些抗体，这表明这两种抗体是通过T细胞依赖的方式产生的。此前，Riemekasten和同事已经证明这两个腹肌与严重的疾病表现和死亡率有关。此外，体外研究发现抗at1r和抗etar抗体是对其受体具有激动作用的功能性抗体[13，14，15]，提示anti-AT1R和anti-ETAR IgG是ssc相关的抗体，可能参与了疾病的发病机制。目前的研究表明，在这个人源化的小鼠模型中，疾病的表现离不开B细胞，这表明自身抗体可能在这个实验模型中也发挥了重要的作用。此外，观察到肺部炎症的严重程度与抗at1r IgG和抗etar IgG的水平呈正相关，支持这些自身抗体在人源化小鼠模型的这种表现的发展中发挥作用。但由于SSc具有多种自身抗体的特点，抗at1r和抗etar IgG抗体在该模型中的作用还需要在未来的研究中进行实验验证。

目前的研究表明，接受化学免疫抑制药物治疗的患者的PBMC与未接受免疫抑制药物治疗的患者的PBMC具有相当的致病性，说明其对患者的保护作用不能转移到小鼠身上。这与我们之前的观察结果相反，即从SSc患者中分离出的PBMC在接受利妥昔单抗治疗的小鼠中几乎没有致病性，这很可能是两种方法不同治疗原则的直接结果。利妥昔单抗治疗是一种细胞靶向治疗，导致B细胞长期耗竭，而免疫抑制药物主要针对淋巴细胞的功能和增殖，以及炎症介质的表达，停药后是可逆的。因此，在实验治疗中将疾病从患者转移到小鼠的能力可能代表一个新的参数来估计新的治疗概念的有效性和可持续性。但需要说明的是，我们患者样本中的免疫抑制药物是一个异质性的化学药物组，使用霉酚酸酯、环磷酰胺等强免疫抑制药物治疗的患者在很大程度上被排除在研究之外。因此，这一发现不排除使用特异性免疫抑制药物，尤其是具有较强免疫抑制作用的药物治疗SSc患者，可能会降低PBMC的致病性。此外，由于本研究分析的患者和小鼠数量有限，这些发现需要仔细解释，需要更多的样本进一步验证。

先前的研究表明原发性胆汁性肝硬化患者的PBMC转移[30.]，系统性红斑狼疮[10和重症肌无力[12]分别在受体小鼠的肝脏、肾脏和肌肉中诱发组织特异性炎症。相反，我们可以证明从SSc患者身上转移PBMC会引起多器官的系统性炎症[8］．自身免疫性疾病小鼠模型间组织参与的差异表明，受体小鼠的疾病表现具有疾病特异性。有趣的是，在目前的研究中，小鼠出现了肺部、肾脏和肝脏的系统性炎症，但在SSc患者的PBMC转移后，没有肌炎的迹象，这与我们之前的研究不同[5］．在后者中，6个SSc PBMC供体中有4个患有肌痛或肌炎[5]，而本研究招募的11例患者均未出现这些表现。这一发现支持了我们之前的假设，即人性化的小鼠模型至少部分反映了相应的患者捐赠者的器官参与。

虽然人性化的小鼠模型为研究SSc的发病机制提供了一个新的工具，但该模型的两个主要局限性需要在这里提到。首先，SSc是一种以自身免疫、炎症、纤维化和血管病变为特征的疾病，而本研究使用的人性化模型仅模拟了部分疾病特征，即自身免疫和全身炎症，代表了SSc的早期阶段。因此，该模型不适合研究纤维化和血管病变的发病机制。其次，理想的移植研究是对患者的PBMC进行移植，而不需要任何治疗。然而，由于SSC患者数量有限，我们不得不招募正在接受各种药物治疗的患者。我们不能排除某些治疗可能会影响小鼠pbmc诱导病理的结果。

总之，本研究首次提供了直接证据，证明人类T细胞和B细胞在人源化的SSc小鼠模型中发挥着关键作用。

研究中提出的原始贡献包括在文章和补充材料中。进一步的询问可与相应的作者联系。

PBMC:

外周血单个核细胞

SSc:

系统性硬化病

AT1R:

血管紧张素- 1型受体

ETAR:

内皮素-1 A型受体

ELISA:

酶联免疫吸附测定

):

苏木精和伊红

包含IHC:

免疫组织化学

作者感谢Christine Engellenner、Diana Heinrich、Carola Schneider、Cindy Hass和Gabriele Marschner提供了出色的技术支持。作者要感谢患者和健康志愿者的参与。

开放获取基金由Projekt DEAL启动和组织。这项工作得到了德国医学协会(Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG)的支持，该协会创立了卓越的炎症精准医学(Precision Medicine in Inflammation)、TI4和CD1项目、RTG 1727“调节自身免疫”和DFG项目RI 1056 11-1/2。此外，小鼠模型是由Eppenauer-Gutzeit基金会和德国肺研究中心(DZL)资助建立的。

作者指出

1. 舒亚庆和岳晓阳对这项工作做出了同等的贡献。

作者和联系

1. 博斯特尔慢性肺病研究中心优先区域，德国肺研究中心(DZL)成员，23845，博斯特尔，德国

   舒亚卿、岳晓阳、Jacqueline Wax、Brigitte Kasper、尹俊平、王晓卿、张亮、Marjan Ahmadi、俞新华、Frank Petersen

2. 广州中山大学附属第三医院神经内科

   Yaqing蜀

3. 广西医科大学基础医学院组织与胚胎学系，广西南宁

   岳晓阳&哈拉尔德·海德克

4. CellTrend GmbH, Im biotechnology park, 14943, Luckenwalde, Germany

   Antje Müller & Gabriela Riemekasten

5. 德国大学风湿学系Lübeck, 23538, Lübeck

   Peter Lamprecht & Gabriela Riemekasten

贡献

GR、XYu和FP参与了本研究的构思和设计。XYue、YShu、JYin、MA、BK、JW、LZ和XW进行了实验工作，并收集和分析了数据。GR, HH, PL和AM通过开发和提供必要材料(献血者的血液样本和elisa)作出贡献。XYu、FP、GR、XYue参与起草稿件。所有作者都参与了稿件的修改。作者阅读并通过了最终稿。

相应的作者

对应到加芙Riemekasten或弗兰克·彼得森．

伦理认可和同意参与

本研究根据1964年赫尔辛基宣言进行，并获得Lübeck大学制度伦理委员会的批准(编号:16-199，日期:2016/11/14)。所有患者均获得书面知情同意。所有动物研究均由德国基尔能源变化、农业、环境、自然和数字化部动物研究伦理委员会批准(编号:V 241 - 50577/2017(108-8/17)，日期:2017.05.10)。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

HH是该公司的所有者，GR是德国CellTrend公司的顾问，该公司生产膜提取物和抗at1r抗体检测测试。所有其他作者声明他们没有竞争利益。

出版商的注意

卡塔尔世界杯常规比赛时间施普林格《自然》对出版的地图和机构附属关系中的管辖权要求保持中立。

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