Calprotectin (S100A8/S100A9)检测接受托珠单抗治疗的类风湿性关节炎患者的炎症活性

背景

在托珠单抗(TCZ)治疗的类风湿性关节炎(RA)患者中，评估血清学炎症是困难的，因为标准炎症参数，如红细胞沉降率(ESR)和c反应蛋白(CRP)，受到白介素6受体抑制的影响。血清中的钙保护蛋白，也被命名为S100A8/S100A9，可能是tcz治疗患者更有用的炎症参数。

方法

纳入69例服用TCZ的RA患者。评估血清钙保护素水平，以及ESR、CRP、因RA活性(=活性RA)而改变疾病缓解抗风湿药物的需求，以及RA临床疾病活性评分(CDAI)。对45例服用肿瘤坏死因子抑制剂(TNFi)的RA患者进行相同参数的研究。

结果

tcz治疗的活动性RA患者的钙保护素值高于非活动性RA患者(4155.5[四分位数范围1865.3-6068.3]vs 1040.0 [676.0-1638.0] ng/ml，P< 0.001)。calprotectin临界值为1916.5 ng/ml，检测RA疾病活性的敏感性和特异性分别为80.0%。钙保护素值与cdai评分相关(r= 0.228;P= 0.011)。ESR和CRP在tcz治疗的患者中不太适合检测RA活性。此外，与非活动性RA相比，tnfi治疗的活动性RA患者的钙保护素值更高(5422.0 [3749.0-8150.8]vs 1845.0 [832.0-2569.0] ng/ml，P< 0.001)。在tnfi治疗的患者中，检测RA活性灵敏度和特异性最好的calprotectin值为3690.5 ng/ml。

结论

尽管tcz治疗，血清中的钙保护蛋白仍然是一个有用的炎症参数。

血清炎症参数是监测炎症性风湿性疾病疾病活动性的有用工具。在类风湿关节炎(RA)中，常规评估的主要是红细胞沉降率(ESR)和c反应蛋白(CRP)。CRP和肝脏中急性期蛋白质合成受白细胞介素-6 (IL-6)调节[1，2］．Tocilizumab (TCZ)是一种抑制IL-6受体的单克隆抗体。随着IL-6受体抑制剂被批准用于RA的治疗，诊断问题出现了，因为ESR和CRP不再能够可靠地显示炎症活性。因此，疾病活度评分，如疾病活度评分(DAS) 28-ESR或DAS28-CRP也受IL-6受体抑制的影响[3.］．简化疾病活度评分(SDAI)也包含CRP，用于计算[4］．因此，疾病活动性的评估更加困难，必须依靠临床检查、成像技术和患者报告的结果参数。因此，作为炎症参数的血清学标记物较少受到IL-6受体抑制的干扰将是有帮助的。

钙保护蛋白是两种钙结合蛋白S100A8和S100A9的异二聚体(同义为钙粒蛋白a和B或髓系相关蛋白[MRP]-8和MRP-14)，是单核细胞和中性粒细胞中的主要胞质蛋白，在感染、恶性肿瘤和炎症期间分泌[5，6］．血液中钙保护素的浓度在接触内毒素后很快增加[7］．Calprotectin可通过上调RA中核因子kappa B诱导巨噬细胞分泌促炎细胞因子[8］．在包括风湿性多肌痛在内的其他炎症疾病中，血清中的钙保护蛋白被证明是一个有用的炎症参数[9]，巨细胞动脉炎[10]，以及脊椎关节炎[11］．迄今为止，测定粪便钙保护蛋白是一种确定炎症性肠病患者肠道活动的既定方法[12］．

对血清中钙保护素作为类风湿关节炎炎症参数的测量(不含IL-6受体抑制剂)进行了研究，并显示其与放射损伤评分和标准炎症参数的相关性[13］．与超声检测到的滑膜炎呈正相关[14］．

关于钙保护素在tcz治疗的风湿性关节炎中应用的资料很少。只有一项涉及33名患者的研究发表[15，这表明钙保护素是有帮助的。除了IL-6受体抑制剂外，钙保护素与类风湿关节炎疾病活性的相关性已被描述为生物疾病修饰抗风湿药物(DMARDs) [16]，并被描述为对疾病活动性比已知的急性期反应物更敏感[17，18］．因此，我们在我们的高等大学中心实施了钙保护素的常规测量，并可以展示钙保护素在接受托珠单抗治疗的RA患者中的使用和有用性的真实数据。

病人和定义

114例患者，符合2010年ACR/EULAR类风湿关节炎分类标准[19]，纳入单中心回顾性研究。进一步的纳入标准如下:TCZ(69例125例患者包含钙保护素值，因为一些患者有多个时间点可用)或肿瘤坏死因子抑制剂(TNFi)(45例患者包含53个钙保护素值)治疗至少3个月，钙保护素-、ESR-和CRP值的可用性和临床评估(包括DAS28-ESR、DAS28-CRP、SDAI和临床疾病活度指数[CDAI])。排除标准是与血清学炎症参数混淆的条件:活动性感染性疾病、目前系统治疗的恶性肿瘤、怀孕和最近4周内的大手术。数据收集于2019年至2022年之间。数据来自患者的电子档案(EMIL由itc .de，马尔堡，德国和SAP SE，华尔道夫，德国)。

CDAI，包括28个肿胀关节，28个压痛关节，患者整体评估和医生整体评估[20.]，对所有患者进行评估，分为cdi缓解≤2.8，低疾病活动度≤10，中度疾病活动度≤22，高疾病活动度> 22 [21］．此外，风湿性关节炎患者被分为两组:(1)非活动性患者，他们继续使用疾病修饰抗风湿药物(DMARD)，而不添加额外的免疫抑制药物;(2)活动性患者，由于风湿性关节炎的炎症活性，他们接受了DMARD的改变或增加。

Calprotectin测量

血清钙保护素收集在血清凝胶瓶中(S-Monovette Z-Gel, Sarstedt, Nümbrecht，德国)，用EliA™calprotectin 2孔(涂有抗钙保护素单克隆小鼠抗体的孔)和Phadia™250设备(均为德国弗莱堡的赛默飞世尔科学公司)测定。对于每个测量周期，分析商业阴性和阳性对照(赛默飞世尔科学公司)。血清样本在采血后1h内离心，保存在2 - 8°C之间，直到测量。用该测定法可在7天内测定稳定的钙保护蛋白值[22］．

在Würzburg大学医院中心实验室测量ESR(第1小时参考范围3 - 8mm)和CRP(参考范围< 0.5 mg/dl)。用免疫比浊法(Tina-quant C-reactive Protein IV, cobas, Roche, Mannheim, Germany)检测CRP。

统计分析

夏皮罗-威尔克检验用于检验正态分布。由于缺少正态分布，中位数与四分位区间(IQR)显示出来。为了测试未配对组之间的差异，曼-惠特尼U对连续变量进行检验，对分类变量进行Fisher确切检验。斯皮尔曼检验用于计算相关性。计算受试者-操作者特征(ROC)曲线，以发现具有最佳敏感性和特异性的截止值。SPSS统计v 28.0 (IBM, Armonk, New York)用于统计分析。数据收集使用Excel (Microsoft, Redmond, Washington)。使用Photoshop (Adobe，圣何塞，加利福尼亚州)对数据进行分组。双尾P -小于0.05为显著值。

接受托珠单抗的RA患者

接受托珠单抗的RA患者的特点

收集了69例RA患者的炎症参数。所有患者接受TCZ治疗至少3个月。69人中的48人(69.6%)为女性;中位年龄为64.0岁(33-89岁)。69例中54例(78.3%)为类风湿因子(RF)阳性;51/69(73.9%)为抗瓜氨酸蛋白抗体(ACPA)阳性。所有acpa阳性患者均为rf阳性。69例中50例(72.5%)皮下接受TCZ, 19例(27.5%)静脉接受。43/69(62.3%)患者无伴发DMARD。69人中的13人(18.8%)接受了泼尼松龙(每日中位数剂量5.0 mg[四分位数范围，IQR 3.3-5.0])， 12/69(17.4%)甲氨蝶呤(MTX)和1/69(1.4%)利福米特(LEF)。 The median activity parameters of the TCZ-treated patients were as follows: DAS28-ESR 1.5 (IQR 1.1–2.2), DSA28-CRP 1.7 (1.2–2.2), SDAI 5.0 (2.0–8.0), and CDAI 5.0 (2.0–8.0). The median inflammation parameters of the TCZ-treated patients were as follows: ESR in 1h 4.0 (2.0–6.0) mm, CRP 0.0 (0.0–0.1) mg/dl, and calprotectin 1072.0 (686.5–1916.5) ng/ml. Patients’ characteristics are summarized in Table1。

钙保护素在托西单抗治疗的活动性风湿性关节炎中增加

接受TCZ的RA患者队列被分为两组:(1)一组患者继续他们的DMARD方案(即托珠单抗+伴随药物)(不活跃)，(2)由于RA的炎症活性需要改变或增加其DMARD的患者(活跃)。125个钙保护蛋白值被纳入本研究，因为一些患者的钙保护蛋白值被测量了不止一个时间点。非活动性RA患者血清中钙保护素值明显较低(n= 115)与活动期患者相比(n= 10) (1040.0 (676.0-1638.0) ng/ml vs 4155.5 [1865.3-6068.3] ng/ml，P< 0.001)(图1一个)。

Calprotectin在检测RA活性时表现出良好的敏感性和特异性，尽管使用了托珠单抗

为了确定具有最佳特异性和敏感性的calprotectin临界值，以检测需要增加或dmard变化的RA活性，我们进行了ROC分析。当calprotectin值为1916.5 ng/ml时，敏感性为80.0%，特异性为80.0%(曲线下面积[AUC] 0.841, 95% CI 0.670-1.012，P< 0.001)(图2一个)。

钙保护素与托西单抗治疗的RA中CDAI和il -6依赖的综合评分相关

钙保护素值与CDAI值呈微弱但显著的相关性(r= 0.228;P= 0.011)(图3.a) calprotectin中位数在CDAI类别间的显著差异:CDAI缓解患者(n= 39)的钙保护素中位数较cdi活性低的患者低(n= 67) (992.0 [615.0-1373.0] ng/ml vs 1225.0 [735.0-2059.0] ng/ml，P< 0.001)。cdai活性低的患者中位钙保护蛋白水平低于cdai活性中等的患者(n= 17) (1430.0 [657.5-3061.5] ng/ml，P< 0.001)。cdi -中度疾病活动度患者的中位钙保护蛋白水平低于cdi -高活动度患者(n= 2) (3283.0 ng/mlP= 0.012)(图4一个)。

此外，calprotectin(尽管tcz治疗)与il -6依赖的综合评分显著相关:与DAS28-ESR (r= 0.301;P< 0.001)， DAS28-CRP (r= 0.237;P= 0.008)，与SDAI (r= 0.234;P= 0.009)(补充图S1）.

标准的炎症参数对检测托珠单抗治疗期间的疾病活动性没有帮助

评估tcz治疗的RA患者的1h ESR和CRP。与活动患者相比，不活动患者在两个参数上没有发现差异(ESR: 4.0 [2.0-5.0] mm vs 7.0 [2.0-12.0] mm，P= 0.104,无花果。1b。c反应蛋白0.0 mg / dl(0.0 - -0.1)和0.1 (0.0 - -0.1)mg / dl,P= 0.075,无花果。1c)。

在tcz治疗的RA患者中，ESR和CRP在区分活动性和非活动性RA患者方面的敏感性和特异性较低(图。2B和c)。

ESR (r= 0.010,P= 0.914,无花果。3.b)或CRP (r=−0.071,P= 0.432,无花果。3.c)具有CDAI值。

ESR和CRP中值在cdi组间无差异(ESR: cdi缓解4.0 [2.0-5.0]mm vs cdi低活性4.0 [2.0-6.0]mm，P= 0.893;cai活性4.0 [2.0-7.0]mm，P= 0.454;CDAI高活度7.0 mm，P= 0.842,无花果。4b. CRP: cdi缓解0.0 [0.0 - 0.1]mg/dl vs cdi低活性0.0 [0.0 - 0.1]mg/dl，P= 0.383;cdi活性0.0 [0.0 - 0.1]mg/dl，P= 0.713;CDAI高活性0.1 mg/dl，P= 0.140,无花果。4c)。

接受tnf α-抑制剂的RA患者

接受tnf α-抑制剂的RA患者的特点

45例服用tnf α-抑制剂(TNFi，至少3个月)的RA患者纳入本研究。患者的特征包括性别、年龄、RF/ acpa状态、伴随的dmard、中位活动评分和中位炎症参数都嵌入在表格中1。比较服用TCZ和TNFi的RA患者显示，服用TNFi的患者更多的是同时服用甲氨蝶呤药物，而较少使用生物单一疗法。与TNFi患者相比，TCZ患者的DAS28-ESR和DAS28-CRP评分较低，而SDAI和CDAI评分无差异。TCZ组中位ESR、CRP和钙保护素值较低1）.

tnf α抑制剂处理的活动性RA中的钙保护蛋白

本研究包括53个钙保护蛋白值，因为有些患者的测量时间点超过一个。接受TNFi治疗的非活跃类风湿性关节炎患者(n= 43)的血清钙保护素(1845.0 [832.0-2569.0]ng/ml)低于活动期RA患者(n= 10)由于RA的炎症活性(5422.0 [3749.0-8150.8]ng/ml，P< 0.001)(图1d)。

钙保护素检测tnf α抑制剂治疗的RA患者RA活性的敏感性和特异性

用ROC分析计算特异度和敏感性最佳的钙保护素临界值。当钙保护素值为3690.5 ng/ml时，敏感性为80.0%，特异性为86.0%(曲线下面积[AUC] 0.909, 95% CI 0.817-1.000，P< 0.001)(图2d)。

在tnf α抑制剂治疗的RA患者中，钙保护素与CDAI和il -6依赖的综合评分相关

Calprotectin值与CDAI值相关(r= 0.401;P= 0.001)(图3.d). cdi缓解的患者(n= 20)的中位钙保护素值为1694.0 [773.5-2983.0]ng/ml，与cdi活性低的患者无显著差异(n= 26) (1848.0 [937.8-2965.5] ng/ml，P= 0.335)。cdai活性低的患者中位钙保护蛋白水平低于cdai活性中等的患者(n= 5) (4264.0 [3488.0-7286.5] ng/ml，P= 0.007)。cdi活性中等的患者与cdi活性高的患者相比，中位钙保护蛋白水平在数值上但无显著性降低(n= 2) (12239.5 ng/ml，P= 0.095)(图4d).钙保护素与il -6依赖的综合评分也存在显著相关性:与DAS28-ESR (r= 0.337;P= 0.005)，伴DAS28-CRP (r= 0.420;P= 0.002)，具有SDAI (r = 0.412;P= 0.002)(补充图S1）.

tnf α抑制剂治疗风湿性关节炎的标准炎症参数

与tcz治疗的患者相比，tnfi治疗的RA患者的ESR和CRP在不活跃和活跃患者之间存在差异(ESR: 12.0 [5.0-21.0] mm vs 22.5 [15.0-53.3] mm，P= 0.021,无花果。1e。c反应蛋白:0.1 (0.0 - -0.3)0.8 mg / dl vs 0.3.6 0.3 mg / dl,P< 0.001,无花果。1f)。

与tcz治疗的RA患者相比，在tnfi治疗的RA患者中，ESR和CRP在区分活动性和非活动性RA患者方面具有更高的敏感性和特异性。2e和f)。

与tcz治疗的患者不同，在tnfi治疗的患者中，CDAI与ESR显著相关(r= 0.410,P= 0.002,无花果。3.e)或CRP (r= 0.364,P= 0.007,无花果。3.f)被检测到。

1h ESR中值在cdai类别之间无显著差异(cdai缓解期的ESR 10.0 [5.0-18.0] mm vs cdai低活性期的ESR 16.5.0 [6.0-28.3.0] mm，P= 0.076;cdi中活性ESR 22.0 [12.0-42.5] mm，P= 0.417 vs低CDAI活性;cdi -高活性中位数54.5 mm，P= 0.381)(图4e).分析CDAI类别之间的中位CRP值:CDAI缓解期CRP值为0.1 [0.0-0.3]mg/dl, CDAI低活动期CRP值为0.1 [0.0-0.4]mg/dl，P= 0.794;cdi中活性CRP 0.7 [0.4-1.6] mg/dl，P= 0.022 vs cdi低活性;CDAI高活性中位CRP 4.2 mg/dl，P= 0.095 vs CRP在cdi -中度活动)(图。4f)。

本研究检测了114例RA患者血清中钙保护素的含量，其中69例接受TCZ治疗，45例接受TNFi治疗。尽管TCZ抑制了il -6受体，我们还是评估了钙保护蛋白作为炎症参数的价值。结果表明，尽管TCZ具有良好的敏感性和特异性，但血清中calprotectin仍适合检测RA活性。此外，尽管tcz治疗，临床综合评分CDAI与calprotectin之间存在显著相关性。相比之下，标准的炎症参数，包括ESR和CRP，不能检测tcz治疗的RA患者的活性。

只有另外一个小组用酶联免疫测定法(ELISA)研究了tcz治疗的ra患者血清中的钙保护素，也发现了钙保护素值与ra活性复合评分之间的显著相关性[15]，这与我们的研究结果一致。

疾病活动度评分，包括DAS28-ESR和DAS28-CRP，其中包含用于计算的血清学炎症参数(在一定程度上)，在tcz治疗组中低于tnfi组。在先前的研究中，接受tcz -治疗的RA患者的DAS28-ESR缓解率高于CDAI或SDAI缓解率，这被认为是由于ESR在DAS28-ESR评分中的权重较高[3.］．因此，我们的方法是选择CDAI作为RA的活动评分，因为CDAI与il -6影响的炎症参数无关。该方法得到了一项发现的支持，即在TCZ和tnfi治疗的RA患者之间，CDAI没有差异。两组间SDAI也无差异，尽管评分包括CRP值。已有研究表明，CRP值对SDAI的影响程度很低[3.，23］．在tcz治疗的RA患者中，ESR和CRP与CDAI值无相关性，但在tnfi治疗的RA患者中，这两个参数与CDAI值有相关性。这一发现可能意味着标准炎症参数比钙保护素更不适合检测炎症活性，因为钙保护素与CDAI值相关，尽管tcz治疗。然而，在评估疾病活动性方面，单一参数不如综合评分有效[24］．当使用IL-6阻断时，必须考虑炎症参数的实施，这些参数几乎不受IL-6受体抑制的干扰，进入复合评分。

以前的研究表明，在RA患者中，可检测到TCZ谷区水平(静脉应用后)的钙保护素值并不比TCZ谷区水平未检测到的患者低，而CRP值则在TCZ谷区水平检测到时较低[15］．这表明钙保护素不受TCZ的影响。但在我们的研究中，钙保护素似乎并不完全独立于TCZ对il -6受体的抑制，因为TCZ治疗的患者的中位钙保护素值低于tnfi治疗的患者。calprotectin检测活性RA与非活性RA的临界值TCZ处理为1916.5 ng/ml, TNFi处理为3690.5 ng/ml。因此，钙保护蛋白在TCZ和TNFi治疗中表现出相当的敏感性和特异性。在tnfi治疗的患者中，RA活性较高似乎不是钙保护素中值差异的原因，因为中值CDAI在tcz治疗和tnfi治疗的患者之间没有差异。

CDAI评分通常在每个患者就诊后直接进行评估，而没有当时可用的炎症参数。在我们的研究中也是如此:评估CDAI评分时不知道各自的钙保护素值(既不知道ESR也不知道CRP)。因此，研究者对CDAI评分的决定不受炎症参数知识的影响。

对血清钙保护素值的分析前因素的担忧已被提出，但最近的研究表明，血清钙保护素在冷藏1周时是稳定的[22］．这种简单的处理方法提供了将血清钙保护素测量转化为常规分析的可能性。

本研究采用回顾性设计和单中心研究方法，具有一定的局限性。此外，未来的纵向研究还需要评估钙保护素作为随访参数及其在检测治疗反应中的有用性。我们大多数患者的疾病活动性较低，CDAI中位值为5，因此高炎症参数只在有限的程度上被纳入我们的研究。

本研究中使用和/或分析的数据可根据合理要求从通讯作者处获得。

ACPA:

Anti-citrullinated蛋白抗体

ACR:

美国风湿病学会

AUC:

曲线下面积

CDAI:

临床疾病活度指数

c反应蛋白:

c反应蛋白

DAS:

疾病活动得分

DMARD:

疾病修饰风湿性关节炎药物

欧拉描述:

欧洲抗风湿病联盟

ESR:

红细胞沉降率

IL:

白介素

差:

四分位范围

中位数:

Leflunomide

MTX:

甲氨蝶呤

拿拿淋:

不适用

类风湿性关节炎:

类风湿性关节炎

射频:

类风湿因子

中华民国:

接受者操作特性

SDAI:

简化的疾病活动指数

TCZ:

托珠单抗

TNFi:

肿瘤坏死因子α -抑制剂

我们感谢Katharina Eckert, Vanessa Drescher, Silke Killinger, Anette kkoss - kinzinger, Isabelle Kuntzsch, Heide Pototzky和Melissa Väth提供专家技术支持和建议。

由Projekt DEAL支持和组织的开放获取资金。本出版物由Würzburg大学开放获取出版基金支持。

作者和联系

1. 德国Würzburg大学医院风湿病和临床免疫学二科，Oberdürrbacher 6, 97080, Würzburg

   Michael Gernert, Marc Schmalzing, Hans-Peter Tony, Patrick-Pascal Strunz & Matthias Fröhlich

2. Asklepios Klinik Altona，风湿病学和临床免疫学，Paul-Ehrlich-Straße 1, 22763，汉堡，德国

   伊娃克里斯蒂娜Schwaneck

贡献

所有的作者都参与了文章的起草或对重要的知识内容进行了批判性的修改，所有的作者都同意将最终版本提交发表。MG对研究中的所有数据都有充分的访问权限，并对数据的完整性和数据分析的准确性负责。研究概念和设计:MG, MF, H-PT。采集数据:MG, MF, P-PS, H-PT, MS和ECS。分析和解释数据:MG, MF和MS。

相应的作者

对应到迈克尔·格纳。

伦理批准和同意参与

本研究是一项回顾性队列研究，为什么Würzburg大学的当地伦理委员会的批准不是强制性的。在本分析中仅采用常规参数(用于三级转诊中心)，为什么根据德国法律不需要获得知情同意。所有数据都是按照《赫尔辛基宣言》编制的。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

MG从艾伯维、Chugai、礼来、Hexal、Janssen、诺华、辉瑞和武田等公司获得了差旅费、顾问团薪酬或演讲费。

MS从艾伯维、Actelion、阿斯利康、BMS、Boehringer/Ingelheim、Celgene、Chugai/Roche、Eli Lilly、Genzyme、Gilead、Hexal/Sandoz、Janssen-Cilag、MSD、诺华、辉瑞、赛诺菲巴斯德、武田(Shire)和UCB获得演讲费、旅费、研究经费或顾问或董事会成员报酬。

H-PT从艾伯维、BMS、Chugai/Roche、Eli Lilly、Gilead、Janssen、Novartis、山德士/Hexal、赛诺菲安万特和武田(Shire)获得演讲费、旅费、研究经费或顾问或董事会成员报酬。

P-PS获得了AbbVie和Janssen-Cilag的旅行资助，以及Chugai的研究资助。

ECS获得了艾伯维、安进、Chugai、礼来、加拉帕戈斯群岛、Janssen-Cilag、诺华、辉瑞、罗氏和武田(Shire)等公司的演讲费、旅费、研究经费或顾问报酬或董事会成员资格。

MF从艾伯维、诺华、杨森和礼来公司获得演讲费、差旅费或董事会成员报酬。

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