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Abatacept下调循环单核细胞上的Fcγ受体I:类风湿性关节炎患者潜在的治疗机制

摘要

背景

Abatacept是一种重组融合蛋白,由细胞毒性T淋巴细胞抗原4的细胞外结构域和免疫球蛋白(Ig) g的Fc部分组成。Abatacept在类风湿关节炎(RA)中的作用机制被认为是通过CD28和CD80/CD86结合抗原提呈细胞介导的T细胞共刺激竞争性抑制。最近的研究表明abatacept以T细胞独立的方式诱导巨噬细胞和破骨细胞前体的反向信号。本研究旨在探讨阿巴替普对RA发病机制中的循环单核细胞的治疗作用。

方法

提取自RA患者和对照组的纯化循环单核细胞,在阿巴替普或CD28-Ig或不存在的情况下培养24小时。对回收的细胞进行流式细胞术检测细胞表面分子的表达水平,并用多重珠阵列检测培养上清中的细胞因子和趋化因子。候选分子的表达进一步通过免疫印迹法检测,使用培养的单核细胞的总细胞提取物。最后,观察阿巴替普对抗瓜氨酸肽抗体(acpa)免疫复合物刺激的单核细胞产生细胞因子的影响。

结果

CD64/FcγRI被鉴定为单核细胞来源的分子,abatacept下调了其表达,但CD28-Ig没有下调。在RA患者和对照组中都观察到了这种效果。abatacept诱导的CD64/FcγRI的下调被抗cd86抗体而非抗cd80抗体所消除。阿巴替普可抑制ACPA免疫复合物刺激培养的单核细胞中白细胞介素-1β、IL-6、C-C基序趋化因子配体2和肿瘤坏死因子-α的产生。

结论

abatacept对RA的治疗作用部分是通过直接与CD86结合,下调循环单核细胞上CD64/FcγRI的表达,抑制免疫复合物介导的炎症细胞因子的产生。

简介

类风湿性关节炎(RA)是一种以慢性多发性关节炎为特征的自身免疫疾病,可导致关节破坏、生活质量受损和预后不良[1].自身抗体的产生与翻译后修饰的自身抗原发生反应,如抗瓜氨酸肽抗体(ACPAs),是RA的自身免疫特征之一,通常在滑膜炎发生之前[2].RA滑膜的致病过程包括各种免疫活性细胞的浸润、炎症细胞因子的产生、滑膜增殖、新生血管、破骨细胞的分化和激活,导致骨软骨破坏[3.].在此过程中,外周血单核细胞浸润关节,并参与其分化为巨噬细胞介导的炎症病理,参与其分化为破骨细胞介导的骨破坏,并增强抗原呈递细胞(APCs)的适应性免疫[4].已有研究表明,acpa通过与瓜氨酸化多肽形成免疫复合物,结合Fcγ受体,诱导炎症细胞因子的产生,激活单核细胞和巨噬细胞,从而促进滑膜炎症[5].

风湿性关节炎的管理是通过针对目标的治疗策略和使用疾病调节抗风湿药物(DMARDs)的早期干预措施的推广而演变的。尤其值得一提的是,对于此前对常规合成dmard反应不足的RA患者,生物dmard在实现临床缓解、疾病活动性降低和阻止关节损伤进展等治疗目标方面发挥着重要作用[6].Abatacept是生物dmard之一,是细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4 (CTLA4)细胞外结构域与人免疫球蛋白G (IgG) Fc部分的融合蛋白[7].T细胞的抗原特异性活化需要T细胞上的CD28和树突状细胞和巨噬细胞等APCs上的CD80/CD86相互作用的共同刺激,以及T细胞受体对APCs上抗原肽的识别[8].为了避免T细胞过度激活,CTLA4,由活化的CD4暂时表达+通过竞争性抑制CD28和CD80/86之间的相互作用,具有抑制抗原特异性适应性免疫反应的能力[9].阿巴替普对RA的治疗作用被认为是通过干扰APCs上CD28与CD80/86的结合来抑制上游的自身免疫和炎症过程而介导的[1011].另一方面,最近有报道称abatacept以不依赖T细胞的方式通过CD80/86直接作用于单核/巨噬细胞和破骨细胞[10].例如,abatacept通过抑制循环破骨细胞前体向功能性破骨细胞的分化,直接抑制破骨细胞的发生,这一过程是由成骨细胞或活化的T细胞表达的NF-κB配体受体激活剂介导的[1213].此外,来自RA患者的滑膜巨噬细胞和Jurkat细胞的短期共培养表明abatacept抑制炎症细胞因子的体外产生,如白细胞介素(IL)-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α [14].这些结果表明,阿巴替普通过直接结合细胞表面的CD80/86对破骨细胞前体和巨噬细胞产生抑制作用。另一方面,abatacept作用于外周血单核细胞的具体机制尚不清楚。本研究采用高纯度单核细胞培养研究阿巴替普对RA患者循环单核细胞的治疗作用。

材料和方法

病人和控制

57例RA患者和12例对照组的外周血标本。RA患者从日本医科大学附属医院的门诊招募。纳入标准符合2010年美国风湿病学会(ACR)/欧洲抗风湿病联盟(EULAR)的分类标准[15],按简化疾病活度指数(SDAI)计算为中度或高度的疾病活度[16和DMARD-naïve status。其他的标准,包括ACPA阳性和初治疗状态,还需要纳入一种测定ACPA-免疫复合物反应的细胞因子产生的方法。对照组包括7名健康个体和5名患有非炎症性风湿性和肌肉骨骼疾病的患者,包括骨关节炎和绝经期疾病。部分患者的外周血样本被反复用于实验。最后,从12例RA和高滴度acpa患者(> 500 U/mL)和5例被证实acpa阴性的健康个体中纯化血清总IgG。本研究获得了日本医科大学附属医院机构审查委员会(27-10-507和30-09-992)的批准,并获得所有受试者的书面知情同意。

高纯度外周血单核细胞的分离

使用淋巴管rep™(Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway)密度梯度离心从肝素化静脉血中分离出外周血单个核细胞(PBMCs)。随后,CD14+根据制造商说明,在细胞用Fc受体阻断试剂(Miltenyi Biotech)预处理后,使用MACS®负选择系统(Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany)从PBMCs中分离单核细胞。为了进一步去除残留的T细胞,随后使用抗cd3单克隆抗体(mAb)偶联磁珠(Miltenyi Biotech)对细胞进行MACS®柱分离。CD3的比例CD14+纯化后的单核细胞部分经流式细胞仪检测,细胞浓度一致为97%。

短期单核细胞文化

高纯度CD14+单核细胞在添加10%热灭活胎牛血清的RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)中重新悬浮,并在5% CO中培养2在没有(mock)或存在阿巴替普(10 μg/mL)的情况下,作用24 h;Bristol-Myers Squibb, NJ, USA)或重组人CD28 Fc嵌合体(CD28- ig) (10 μg/mL;研发系统,MN,美国)。回收上清,在4℃下用含有2mm乙二胺四乙酸的磷酸盐缓冲盐水仔细刮取贴壁细胞。在时间过程实验中,添加或不添加阿巴昔普的单核细胞培养物在6、24或48小时收获。在一些实验中,阿巴昔普处理的单核细胞在抗cd80单抗/克隆2D10.4、抗cd86单抗/克隆IT2.2、抗cd80 +抗cd86单抗的组合或同型匹配的对照单抗(10 μg/mL;Thermo Fisher科学公司,Waltham, MA, USA)。重组人IgG1-Fc (10 μg/mL;在阿巴替普存在的情况下加入单核细胞培养。

单核细胞培养与acpa免疫复合物

首先将人纤维蛋白原(Abcam, Cambridge, UK)通过蛋白G柱(GE Healthcare, IL, USA)去除残留的IgG,并与1 mg/mL兔精氨酸肽脱亚胺酶(PAD;7单位/毫升;Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)的反应缓冲液(0.1 M Tris-HCl pH 7.4, 10 mM CaCl2,和5 mM二硫苏糖醇)在37°C 2 h [17].超滤后用磷酸盐缓冲盐水代替溶液,得到瓜氨酸纤维蛋白原。用G蛋白柱从acpa阳性RA血清和acpa阴性健康对照血清中纯化IgG片段[18].主要如前所述,通过酶联免疫吸附试验评估pad诱导的纤维蛋白原瓜氨酸化[19].简单地说,PAD或模拟处理的纤维蛋白原(100 μg/mL)重复涂覆在96孔聚乙烯醇板(Sumilon多孔板H型;住友胶木,东京,日本)。用含3%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水阻断后,用纯化的acpa阳性IgG (100 μg/mL)、acpa阴性IgG (100 μg/mL)、acpa阳性RA患者血清稀释1:50或acpa阴性健康对照血清稀释1:50孵育孔,随后用过氧化物酶偶联抗人IgG(美国PA Jackson免疫研究实验室)稀释1:20万孵育孔。洗涤后,结合抗体用溶解于二甲亚砜、磷酸酯-柠檬酸缓冲的四甲基联苯胺底物(Sigma-Aldrich)显示,加入1N硫酸终止反应。在450nm处的光密度(OD450然后用微板阅读器(Agilent Technologies, CA, USA)进行阅读。

用瓜氨酸纤维蛋白原(20 μg/mL)预包被96孔微孔板,用含3%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水阻断,并与acpa阳性或acpa阴性IgG (100 μg/mL)孵育[19].来自ACPA阳性、治疗初期RA患者的外周血单核细胞悬浮在无血清巨噬细胞培养基中(赛默飞雪科学公司),并在ACPA免疫复合物预包覆的96孔微板上以5万个细胞/孔的速度[20.].在37°C和5% CO条件下,在abatacept (10 μg/mL)存在或不存在的情况下处理细胞224 h后收集上清。

多色流式细胞术

使用CellQuest™Pro软件(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ),在FACSCalibur™流式细胞仪上分析CD16/FcγRIII、CD32/FcγRII、CD40、CD54、CD62L、CD64/FcγRI、CD80、CD86、CD181/CXCR1、CD182/CXCR2、CD184/CXCR4、CD191/CCR1、CD192/CCR2、CD194/CCR4、CD195/CCR5、CD273/程序性死亡配体(PD-L) 2、CD274/PD-L1、CD275/诱导型T细胞共刺激配体、CX3CR1和人白细胞抗原(HLA) dr在培养单核细胞上的表面表达。这些分子是根据它们在RA致病过程中的潜在参与而选择的,如先前报道的1:表S1)。存活细胞的鉴别通过门控前向和侧向散射,数据显示为对数点图或直方图。门控CD14上单个细胞表面分子的表达水平+对细胞进行分析,并以平均荧光强度(MFI)比率表示,其计算方法是用相关单克隆抗体染色细胞的MFI除以相应同型匹配对照单克隆抗体染色细胞的MFI。

细胞因子和趋化因子的测定

根据制造商说明,使用BD™细胞珠阵列(Human CBA FLEX Sets, BD Biosciences)测量培养上清中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、干扰素(IFN)-γ、C-C基序趋化因子配体2 (CCL2)和TNF-α的浓度。简单地说,培养上清与细胞因子珠混合物孵育,并在FACSCalibur™流式细胞仪上使用定量软件(FCAP Array™v3.0;BD生物科学)。

免疫印迹

培养的单核细胞经10%聚丙烯酰胺-十二烷基硫酸钠凝胶电泳,然后在硝化纤维素膜上印迹。先用3%牛血清白蛋白、0.05% Tween 20在tris缓冲盐水中孵育膜,然后用兔抗cd16多克隆抗体、抗cd32a /FcγRIIa多克隆抗体、抗cd32b /FcγRIIb单抗/克隆EP888Y、抗cd64 /FcγRI单抗/克隆EPR4623、抗cd80单抗/克隆EPR1157或抗cd86单抗/克隆EP1158Y孵育膜(均购自Abcam)。小鼠抗-β-肌动蛋白单抗/克隆AC-74 (Sigma-Aldrich)作为负载对照。在与辣根过氧化物酶偶联抗兔或抗小鼠IgG (Thermo Fisher)二抗孵育后,使用增强化学发光试剂盒(Western Lighting Plus-ECL;PerkinElmer沃尔瑟姆,MA)。感兴趣的分子是根据报道的分子大小确定的。每个蛋白带的信号强度用ImageJ软件(https://imagej.nih.gov/ij/),表示为强度比,其计算方法为相应条带的强度除以β-actin条带的强度。

统计分析

所有连续值均以平均值±标准差(SD)或中位数和四分位差表示。两组间比较采用非参数Mann-Whitney法进行统计学意义分析U使用IBM SPSS统计23.0版本(IBM, New York, NY, USA)进行测试。

结果

筛选暴露于阿巴替普后特异性表现差异表达的单核细胞衍生分子

DMARD-naïve RA患者和用于衍生或验证实验筛选暴露于abatacept后差异表达的单核细胞衍生分子的对照组的人口统计学和临床特征列在附加文件中1S2:表。大多数RA患者早期发病,中位病程约为2个月,关节破坏最小(Steinbrocker I期≥70%)。在筛选中RA患者与对照组的年龄和性别不匹配,而在验证实验中RA患者与对照组的年龄和性别比较平衡。

为了筛选短期接触abatacept后其表达发生变化的分子,来自5名RA患者和5名对照组的外周血单核细胞被用于衍生实验,其中涉及20个细胞表面分子(附加文件1:图S1)和8个细胞因子/趋化因子(附加文件1:图S2)。IL-12p70在所有样本中均未检测到。结果,与模拟培养相比,abatacept在RA患者或对照单核细胞培养中显著下调或上调CD64/FcγRI、CD80、CD86和CXCR2被选为候选分子(P< 0.1)。

在20例RA患者和8例对照组的外周血单核细胞验证实验中,进一步分析了CD64/FcγRI、CD80、CD86和CXCR2的表达变化。1).abatacept培养物中CD64/FcγRI的表达水平明显低于RA患者细胞的模拟培养物(P< 0.001)和对照(P= 0.02)。相比之下,含CD28-Ig的培养物与模拟培养物的表达水平无差异,表明CD64/FcγRI的表达变化与abatacept暴露有关。模拟培养中RA患者和对照组CD64/FcγRI表达水平相似(3.95±1.89 vs 3.50±0.97),无论RA是否存在,abatacepp诱导的CD64/FcγRI表达下调均可见。使用3个对照组的外周血单核细胞进行的时间过程实验显示,在阿巴替普存在的6小时内可以观察到CD64/FcγRI表达下调,并持续至少48小时1:图S3)。另一方面,阿巴替普培养物中CD80和CD86的表达水平与模拟培养物相比无统计学差异,而在RA单核细胞中,阿巴替普暴露后CD80和CD86有下调的趋势(P= 0.13和0.09)。由于abatacept可能会干扰抗CD80或抗CD86单抗的结合,用流式细胞术定量评价CD80和CD86可能不准确,我们决定通过免疫印迹分析全细胞裂解液来进一步检测CD80和CD86的表达。最后,abatacept与模拟培养物相比,CXCR2表达水平降低(PRA和对照组分别为0.001和0.08),而与模拟培养相比,CD28-Ig培养的CXCR2表达也降低(P< 0.001和PRA和对照组分别为= 0.03),表明CXCR2的下调与abatacept的暴露无关。

图1
图1

流式细胞术显示abatacept暴露后单核细胞CD64/FcγRI的下调。外周血单核细胞在无(mock)或存在abatacept (ABT)或CD28-Ig的情况下培养24 h, CD64/FcγRI (一个)、CD80、CD86和CXCR2 (B)采用流式细胞术检测。从20例RA患者和8例对照组中提取外周血单核细胞,用于验证实验。细胞表面表达用平均荧光强度(MFI)比表示。有代表性的直方图显示了在RA患者和对照组中CD64/FcγRI的表达。结果显示在箱线图中,两组之间的统计比较使用曼-惠特尼量表U测验

Abatacept通过IgG1-Fc部分与CD64/Fcγ ri结合,可能会干扰流式细胞术对CD64/Fcγ ri的检测,尽管这不太可能,因为Abatacept的IgG1-Fc部分被氨基酸取代修饰,降低了其与Fcγ受体的结合亲和力[21],在单核细胞分离过程中使用Fc受体阻断试剂。为了消除这种可能性,我们用流式细胞术检测了5例RA患者的单核细胞中CD64/FcγRI的表达水平,无论阿巴替普或完整的人IgG1-Fc是否存在。CD64/FcγRI的表达不受人类IgG1-Fc的影响,但abatacept的存在降低了CD64/FcγRI的表达1:图S4)。

免疫印迹证实abatacept诱导单核细胞CD64/FcγRI下调

通过免疫印迹分析在无(mock)或有abatacept或CD28-Ig培养的单核细胞的全细胞裂解液,进一步检测CD64/FcγRI的蛋白表达。另外还检测了附加的Fcγ受体(CD16/Fcγ riii, CD32a/Fcγ riia,和CD32b/Fcγ riib)和CTLA4配体(CD80和CD86)的表达(图1)。2).在11例RA患者外周血单核细胞中,abatacept诱导CD64/FcγRI表达下调,而CD28-Ig未诱导CD28-Ig表达下调。P< 0.001)。5个对照组的外周血单核细胞免疫印迹分析显示相同趋势,但差异无统计学意义(P= 0.17)。在模拟培养中,RA患者中CD64/FcγRI的表达高于对照组(0.70±0.21比0.46±0.10),P= 0.07)。相比之下,在模拟培养物和abatacept或CD28-Ig培养物之间,CD80、CD86、CD32a/FcγRIIa、CD32b/FcγRIIb和CD16/FcγRIII蛋白表达水平无差异。

图2
图2

免疫印迹法显示,阿巴替普暴露后单核细胞CD64/FcγRI下调。取11例RA患者和5例对照组外周血样本进行免疫印迹检测。在无(mock)或有abatacept或CD28-Ig培养24 h的单核细胞全细胞提取物中CD64/FcγRI、CD80、CD86、CD32a/FcγRIIa、CD32b/FcγRIIb和CD16/FcγRIII的蛋白表达。具有代表性的免疫印迹图像,右侧显示RA患者的分子量标记位置(一个).使用ImageJ软件对单个蛋白条带的信号强度进行量化,并以强度比表示,强度比由感兴趣条带的强度除以β-肌动蛋白条带的强度(B).结果显示在箱线图中,两组之间的统计比较使用曼-惠特尼量表U测验

通过abatacept与单核细胞CD86结合下调CD64/FcγRI

为了研究CTLA4配体(CD80或CD86)参与了abatacept诱导的单核细胞CD64/FcγRI的下调,我们将5例RA患者的外周血单核细胞与abatacept一起培养,在存在或不存在抗CD80单抗、抗CD86单抗、抗CD80 +抗CD86单抗的组合或同型对照单抗的情况下进行。3.).abatacept诱导的CD64/FcγRI的下调在抗CD86单克隆抗体存在时被取消,但单抗cd80单克隆抗体不存在,这表明CD86与abatacept结合并导致单核细胞上CD64/FcγRI的下调。

图3
图3

通过abatacept与单核细胞CD86结合下调CD64/FcγRI。在短期单核细胞培养中检测了抗cd80、抗cd86、两种单克隆抗体或同型匹配单克隆抗体对abatacept诱导的CD64/FcγRI下调的影响。5例RA患者的外周血样本被用于研究。细胞表面CD64/FcγR的表达用平均荧光强度(MFI)比值表示。结果显示在箱线图中,两组之间的统计比较使用曼-惠特尼量表U测试。给出了3个独立实验的代表性结果

阿巴替普对ACPA免疫复合物刺激的单核细胞产生细胞因子/趋化因子的影响

由于有报道称RA患者外周血单核细胞衍生的巨噬细胞与ACPA免疫复合物结合后产生炎症细胞因子和趋化因子[22], abatacepp诱导的单核细胞上CD64/FcγRI的下调可能抑制ACPA免疫复合物诱导的ACPA阳性RA患者炎症细胞因子/趋化因子的产生。为了验证这一假设,从19例ACPA阳性和治疗初见的RA患者中分离出外周血单核细胞,并在无(mock)或有abatacept的情况下用ACPA免疫复合物进行培养。酶联免疫吸附试验中acpa阳性IgG对瓜氨酸纤维蛋白原的特异性识别证实了pada诱导的纤维蛋白原瓜氨酸化1:图S5)。2例患者被排除,因为在模拟培养的上清液中没有检测到任何细胞因子/趋化因子。其余17例患者培养上清中未检出IL-10、IL-12p70和IFN-γ。abatacept处理的培养物中IL-1β、IL-6、CCL2和TNF-α的水平明显低于模拟培养物(P= 0.01, 0.02, 0.001,和0.03),而IL-8水平在培养物之间无差异(图5)。4).

图4
图4

阿巴替普对ACPA免疫复合物刺激的单核细胞产生细胞因子/趋化因子的影响。本研究从17例类风湿关节炎患者的外周血中提取样本并使用。用多重珠阵列法测定IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8和CCL2的浓度。两组间的统计比较采用曼-惠特尼量表U测验

讨论

我们已经证明abatacept与外周血单核细胞上的CD86结合,并在24小时内以T细胞独立的方式下调CD64/FcγRI的表达。此外,abatacept能够抑制ACPA免疫复合物诱导的单核细胞中炎症细胞因子/趋化因子(如TNF-α和IL-6)的产生。abatacept的这些T细胞独立机制可能有助于抑制RA的发病,尽管没有直接证据表明CD64/FcγRI的下调与抑制细胞因子/趋化因子的产生有关。这种快速作用可能是阿巴替普治疗后疾病活度指数相对快速改善的原因之一,其效果与TNF抑制剂的效果相当[23].阿巴他普抑制ACPA免疫复合物诱导的单核细胞产生炎症细胞因子/趋化因子的能力也可以解释为什么阿巴他普的临床疗效在ACPA阳性RA患者中比在ACPA阴性RA患者中更显著,且ACPA滴度高的RA患者对阿巴他普的反应更好[24].

据报道,RA患者的循环单核细胞比健康对照组的细胞表现出更高水平的激活FcγRs,包括CD64/FcγRI [25].我们使用全单核细胞提取物进行免疫印迹分析,观察到这一趋势。据报道,在接受甲氨蝶呤或TNF抑制剂治疗的RA患者中,外周血单核细胞CD64/FcγRI表达降低,尤其是那些反应良好的患者[2627提示单核细胞上CD64/FcγRI表达与RA疾病活性之间的关系。然而,抗TNF-α单克隆抗体未能下调体外单核细胞上CD64/FcγRI的表达,提示单核细胞上CD64/FcγRI表达的降低是TNF-α阻断对疾病活性的间接影响[27].直接下调外周血单核细胞CD64/FcγRI表达的能力可能是abatacept的独特作用。

在我们的研究中,阿巴他普抑制了ACPA免疫复合物刺激的单核细胞培养中炎症细胞因子的产生。在单核细胞单独培养中没有观察到阿巴替普的这种抑制作用,这表明阿巴替普的作用可能是通过下调CD64/FcγRI的表达和减少单核细胞对ACPA免疫复合物的摄取来介导的。这一效应类似于先前的一份报告,该报告显示ACPA免疫复合物诱导的IL-1β、IL-6、IL-8、CCL2和TNF-α的产生被abatacept治疗后被抑制在CD68体外产生的巨噬细胞的培养中+存在巨噬细胞集落刺激因子的RA患者外周血单核细胞[28].然而,最近一项使用来自RA患者外周血单核细胞的巨噬细胞的研究表明,低亲和力CD32a/Fcγ riia是捕获ACPA免疫复合物和促进TNF-α生成的主要Fcγ受体[20.].这一发现与我们的结果之间的差异可能是由单核细胞和巨噬细胞上Fcγ受体表达谱的显著差异所解释的:CD64/Fcγ ri在单核细胞上的表达高于巨噬细胞[29].

循环单核细胞上表达的CD64/FcγRI也参与了循环单核细胞向功能性树突状细胞的分化。具体来说,通过CD64/FcγRI对IgG免疫复合物的吞噬增强了HLA II类分子的细胞表面表达,并将单核细胞分化为树突状细胞,从而增强了诱导抗原特异性T细胞启动和扩增的能力[30.31].综上所述,阿巴替普诱导外周血单核细胞CD64/FcγRI表达下调可能通过多种机制促进RA病理抑制。

本研究聚焦于CD64/FcγRI作为细胞表面分子在abatacept暴露后的下调。其他单核细胞衍生的分子,如CD15、CD54、CD80和CD102,在体外单核细胞培养中暴露于阿巴替普后被显示下调,但这些发现不一定与其他人一致[10323334].在这方面,我们的研究中观察到abatacepe诱导的细胞表面CD54和CD80表达的抑制趋势,但由于分析的受试者数量较少,可能在筛选实验中不够敏感,无法检测到微小的变化。很可能是实验条件的差异,如单核细胞来源(疾病持续时间、疾病活度和在RA患者中使用DMARDs)、单核细胞培养条件和限定表达水平的方法(流式细胞术、免疫印迹法和定量PCR法)影响结果。更重要的是,已有研究表明,abatacept诱导的几种单核细胞粘附分子的表达显著减少,导致单核细胞与内皮细胞的粘附减少,有助于减轻关节滑膜组织的炎症[33].Cutolo等人最近报道,在RA患者和健康供体的单核细胞源性巨噬细胞培养物中,abatacept治疗可诱导M1巨噬细胞向M2巨噬细胞转移[35].由于使用人类pbmc来源的巨噬细胞对M1特异性和M2特异性表面表型的差异筛选发现,与M2巨噬细胞相比,CD64/FcγRI作为M1上上调的分子[36],在我们的研究中观察到CD64/FcγRI的下调可以用M1表型向M2表型的转移来解释。

本研究存在局限性。目前的数据没有直接证据表明阿巴替普对单核细胞产生的细胞因子/趋化因子的影响是通过下调CD64/FcγRI介导的。在体外培养中,使用toll样受体配体和非ACPA免疫复合物作为潜在的单核细胞刺激剂,而不是ACPA免疫复合物,可能为abatacept诱导的抑制ACPA免疫复合物介导的炎症细胞因子产生的机制提供有用的见解。此外,我们的研究结果是在体外短期培养的外周血单核细胞中获得的,尚不清楚所提出的机制是否真的适用于RA患者。进一步研究acpa阳性和acpa阴性RA患者的外周血单核细胞表型和细胞因子产生的时间变化,以确认abatacept的体内治疗效果是必要的。

结论

体外分析结果提示abatacept可通过CD86反向信号直接下调外周血单核细胞CD64/FcγRI的表达,抑制ACPA免疫复合物介导的炎症细胞因子的产生。我们的研究结果有助于理解阿巴他普独特的治疗作用模式,与其他生物dmard不同,阿巴他普具有多方面的作用,预计将有助于阿巴他普在临床实践中的充分使用。

数据和材料的可用性

本研究中分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。

缩写

类风湿性关节炎:

类风湿性关节炎

ACPA:

Anti-citrullinated肽抗体

APC:

抗原呈递细胞

DMARDs:

疾病修饰风湿性关节炎药物

CTLA4:

细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白

IL:

白介素

肿瘤坏死因子:

肿瘤坏死因子

马伯:

单克隆抗体

搞笑:

免疫球蛋白

HLA:

人类白细胞抗原

小额信贷机构:

平均荧光强度

干扰素:

干扰素

PD-L:

程序性死亡配体

垫:

Peptidylarginine deiminase

OD450

450nm处的光密度

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资金

这项研究得到了Ono制药和百时美施贵宝以及日本医科大学医学院研究生院的研究资助。

作者信息

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作者

贡献

工作的概念或设计:MK.采集和分析:RF和YO。数据的解释:RF, TG和MK。工作的起草或重要知识内容的批判性修订:所有作者。出版版本的最终审批权:所有作者。

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道德声明

伦理批准和同意参与

本研究由日本医学院医院伦理委员会批准(批准号27-10-507和30-09-992)。在根据《赫尔辛基宣言》的原则收集样本之前,取得所有受试者的书面知情同意。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

MK获得了来自勃林格殷格翰、小野制药和MBL的研究拨款和个人费用,以及来自艾伯维、朝日Kasei制药、阿斯泰来、Chugai、Corbus、卫材、葛兰素史克、Janssen、Mochida、日本新yaku和Tanabe-Mitsubishi的个人费用。

额外的信息

出版商的注意

卡塔尔世界杯常规比赛时间施普林格自然对出版的地图和机构附属的管辖权要求保持中立。

补充信息

附加文件1:表S1。

用于流式细胞术检测的细胞表面分子和单克隆抗体列表。表S2。一系列实验中使用的类风湿关节炎患者和对照组的人口统计学和临床特征。图S1。abatacept短期培养后差异表达的单核细胞源性细胞表面分子的筛选。5例类风湿性关节炎(RA)患者和5例对照组的外周血样本用于衍生实验。循环单核细胞在无(mock)或有abatacept (ABT)或CD28-Ig的情况下培养24小时。用流式细胞仪量化细胞表面表达,用平均荧光强度(MFI)比表示。两组间的统计比较采用曼-惠特尼量表U测试。图S2。筛选abatacept短期培养后差异表达的单核细胞源性细胞因子/趋化因子。5例类风湿性关节炎(RA)患者和5例对照组的外周血样本用于衍生实验。循环单核细胞在无(mock)或有abatacept (ABT)或CD28-Ig的情况下培养24小时。用多重珠阵列法测定白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8、IL-10、C-C基序趋化因子配体2 (CCL2)和肿瘤坏死因子(TNF)-α的浓度。两组间的统计比较采用曼-惠特尼量表U测试。图S3。abatacept诱导单核细胞CD64/FcγRI下调的时间进程。取3个对照组的外周血样本,加入或不加入abatacept培养6、24和28小时。用流式细胞术定量CD64/FcγRI的表达水平,并以CD64/FcγRI的表达比表示,表达比由加阿巴替普培养的单核细胞的平均荧光强度比除以不加阿巴替普培养的单核细胞的平均荧光强度比计算。结果用均值和标准差表示。给出了两个独立实验的代表性结果。图S4。abatacept诱导单核细胞上CD64/FcγRI的下调与abatacept的IgG1-Fc部分无关。取5例类风湿关节炎(RA)患者外周血单核细胞,不加(mock)、加阿巴昔普或完整的人IgG1-Fc培养24小时。用流式细胞术定量检测CD64/FcγRI的表达水平,并以平均荧光强度(MFI)比表示。结果显示在箱线图中,两组之间的统计比较使用曼-惠特尼量表U测试。给出了3个独立实验的代表性结果。图S5。通过酶联免疫吸附法特异性识别acpa阳性IgG证实了肽酰精氨酸脱亚胺酶(PAD)诱导的纤维蛋白原瓜氨酸化。用纯化的acpa阳性IgG、acpa阴性IgG、acpa阳性RA患者血清或acpa阴性健康对照组血清,分别将PAD或模拟处理的纤维蛋白原包覆在96孔聚乙烯醇平板上进行酶联免疫吸附试验。所有测量均重复进行,结果以均数±标准差表示。给出了3个独立实验的代表性结果。

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fuue, R,冈崎,Y, Gono, T。et al。Abatacept下调循环单核细胞上的Fcγ受体I:类风湿性关节炎患者潜在的治疗机制。关节炎Res其他24194(2022)。https://doi.org/10.1186/s13075-022-02886-8

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关键字

  • 类风湿性关节炎
  • Abatacept
  • 单核细胞
  • Fcγ受体
  • Anti-citrullinated肽抗体
  • 细胞因子