炎症细胞因子和机械损伤诱导人软骨-骨-滑膜微生理系统发生创伤后骨关节炎样变化gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

人类的创伤性膝关节损伤会立即引起滑膜液中炎症细胞因子水平的增加，伴随撞击损伤的是关节组织。我们开发了一个人体外软骨-骨-滑膜(CBS)共培养模型来研究机械损伤和炎症在创伤后骨关节炎(pta)样疾病起始过程中的作用。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

骨软骨栓(软骨骨，CB)和关节囊滑膜外植体(S)取自16名供体(Collin分级0-2,23 - 83岁)25具尸体远端股骨。建立两周的单培养(软骨(C)，骨(B)，滑膜(S))和共培养(CB, CBS)。采用滑膜外植体与机械阻生骨软骨栓(CBS+INJ，峰值应力5MPa)共培养的方法建立ptoa样疾病组，与无阻生骨软骨栓共培养的滑膜外植体作为对照组。通过分析细胞活力、释放到培养基的炎症细胞因子(10-plex ELISA)、组织基质降解和代谢组学谱的变化，评估疾病样进展。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在CBS+INJ和CBS共培养物以及单独与S培养物(IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α等)中，炎症细胞因子浓度立即升高。与未受伤的CB相比，CBS+INJ和CBS也显示软骨细胞死亡增加。CBS和CBS+INJ组向培养基释放的硫酸糖胺聚糖(sGAG)和相关的ARGS-aggrecan新表位片段显著增加。观察到C、B和S单培养物的不同代谢组学特征，并鉴定出与CBS与CB的炎症反应相关的代谢物(例如，kynurenine、1-甲基烟酰胺和次黄嘌呤)。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

CBS和CBS+INJ模型显示与pto -like起始/进展相关的明显细胞、炎症和基质相关改变。使用来自既往无OA病史供体的人类膝关节组织表明，该模型在PTOA进展的早期阶段突出损伤和炎症作用的相关性。gydF4y2Ba

创伤后骨关节炎(PTOA)是现代肌肉骨骼医学未解决的主要问题。它折磨着全球超过7500万人[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．它是创伤性关节损伤的结果，通常包括前交叉韧带(ACL)或半月板撕裂，这些损伤的发生率随着时间的推移而增加[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．随着PTOA的进展，纤维性颤动和软骨体积的减少，伴随着滑膜和关节囊的增生和纤维化，软骨下骨硬化，骨赘和囊肿的形成[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．不幸的是，手术修复并不能降低PTOA进展的风险[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]，患有晚期PTOA的人往往太年轻，不适合做关节置换术。PTOA的病因尚未阐明，也没有已知的治疗方法。gydF4y2Ba

MRI显示，高达90%的前交叉韧带损伤伴有骨软骨病变，这表明软骨在损伤时承受着较高的机械冲击[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．这种急性过载本身会导致基质改变、细胞死亡和软骨下骨损伤[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．此外，多项研究报告称，早在膝关节损伤后24-48小时，患者滑膜液中的炎症细胞因子以及软骨和骨标记物就会增加[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1β、IFNγ等的水平在损伤后可持续升高至5年，并与aggrecan、II型胶原蛋白的蛋白水解有关[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]，以及附加的软骨基质分子以及伴随的骨变化导致完全发育的PTOA [gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

OA/PTOA的体内动物模型和分离软骨和骨的体外研究揭示了与PTOA进展相关的降解过程的重要见解[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．最近，更先进的体外共培养模型提供了进一步的方法，以实现机制理解和平台的药物发现和药物传递[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．这对PTOA的早期阶段尤其有用，因为人类的临床研究通常专注于更晚期的OA [gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．由于pto是一种全关节疾病，包括软骨、骨、滑膜、韧带和半月板[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]，聚焦于单个孤立组织的体外模型未能纳入组织之间的串扰，而串扰对于疾病的病理生理学和潜在治疗靶点的评估至关重要[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．利用单层细胞或支架中细胞的3D培养的实验往往无法重现完全发育的细胞外富含基质的肌肉骨骼组织的原生生物学特性[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

先前的体外研究表明，仅机械损伤软骨就会导致软骨细胞死亡[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，基质降解增加[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]，以及改变软骨细胞的生物合成[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．然而，考虑到炎症和机械创伤对人类PTOA发病机制中骨软骨单元的综合影响，将关节囊滑膜组织包括在外植体共培养系统中是最有启发意义的[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．由于难以获得接近正常的人类膝关节组织，以前的大多数人类共培养研究都使用了膝关节成形术的组织。虽然这种终末期骨性关节炎组织可能提供有价值的见解，但来自无骨性关节炎病史的供体组织可能最有助于研究PTOA发展早期阶段的细胞和机制事件，为发现生物标志物和治疗靶点奠定基础。gydF4y2Ba

因此，本研究的总体目标是开发一种人类软骨-骨-滑膜(CBS)共培养系统，包括冲击机械损伤(INJ)，以模拟PTOA起始和炎症环境中的早期事件。我们假设这种CBS+INJ共培养可以在体内模拟与创伤性关节疾病相关的某些途径和生理机制。我们的具体目标是(1)建立和描述CBS模型，包括人类膝关节骨软骨塞与取自同一膝关节的关节囊滑膜外植体共培养，(2)以一种模拟急性膝关节损伤引起的骨软骨损伤的方式对骨软骨塞进行单次损伤性冲击压缩，(3)使用CBS+INJ系统研究早期pto -like起始和进展，重点关注细胞活力的变化。基质组成和降解，个别软骨、骨和滑膜组织的代谢组学读数，以及与接近正常的人骨软骨组织和炎症滑膜共培养相关的代谢组学变化。gydF4y2Ba

组织的收获和培养gydF4y2Ba

来自16名人类捐献者(年龄23-83岁，8男8女)的25个膝盖是在死后从捐赠银行(希望之礼物器官和组织捐赠网络，伊塔斯卡，伊利诺伊州;NDRI、费城、PA;(见补充表SgydF4y2Ba1gydF4y2Ba关节和供体特性列表)。所有的实验过程都得到了麻省理工学院人体实验委员会的批准。采用改进的Collins分级系统对节理面进行分级[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba都是0 - 2级(总分4)，其中0表示正常，4表示终末期OA。由于我们的目标是在最初尽可能无疾病的关节中启动pto -like疾病，既往有任何OA诊断或抱怨的捐赠者被排除在外。在死亡后36-48小时内，从股骨远端髌骨和髁突区域采集骨软骨栓，显示软骨表面无明显颤动或病变(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa)包括滑膜和纤维关节囊的全层组织(在表S中统称为“滑膜-S”)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)从相同的供体膝关节中获得。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab).外科镶嵌成形术工具集(Smith & Nephew, Cat No. 7207098，图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac)用于收获(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bad)圆柱形骨软骨栓(直径3.5 mm，长10 - 12mm)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bae, f))分布在实验条件中，这样所有研究组的股骨髌和髁区域都有代表(见补充方法)gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba获取详细信息)。收集的骨软骨栓(表S中称为软骨骨(CB))gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)先在含有1%链霉菌-两性霉素溶液的PBS中冲洗，然后在由高糖DMEM [4.5 g/l]添加1% ITS(分别为10μg/ml、5.5μg/ml和5ng/ml的胰岛素-转铁蛋白-硒)组成的无血清培养基中预平衡2-3天;Sigma)， 10 mM HEPES缓冲液，0.1 mM非必需氨基酸，0.4 mM脯氨酸，20 μg/ml抗坏血酸，100 U/ml青霉素G, 100 μg/ml链霉素，和0.25 μg/ml两性霉素(预孵育培养基)，5% COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba, 37°C。来自同一供体的滑膜组织分别在预平衡培养基中预培养，直到实验开始。预平衡后，所有后续2 - 4周的单培养和共培养均使用修改后的含低糖DMEM (1g/l)的预培养培养基(培养培养基)。gydF4y2Ba

单一栽培gydF4y2Ba

每个骨软骨塞的软骨下骨(B)首先使用litauer骨切割器(Fine Science Tools, Cat。No. 16152-12)以确保骨组织外植体的尺寸一致。全层软骨(gydF4y2BaCgydF4y2Ba)然后从下面的软骨下骨分离。使用外科剪刀，将滑膜(S，包括原生滑膜和底层纤维囊组织)切成全厚度的外植体(每个4-5毫米)，以代表所有细胞/分子成分对损伤后事件的影响。实验开始时，分别将C、B和S外植体置于500μl (5% CO)的培养基中培养2-4周gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba, 37°C)。gydF4y2Ba

CoculturesgydF4y2Ba

完整的骨软骨塞(gydF4y2BaCBgydF4y2Ba)分别在1ml培养液中单独培养或与单个滑膜移植体共培养(gydF4y2Ba哥伦比亚广播公司gydF4y2Ba)在1.5 ml培养基中进行单独研究(图5)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bag).为了解决从每个关节表面不同区域收获的CB塞的可变性，以及S滑膜外植体的细胞和基质成分的可变性，从每个关节的所有收获区域获得的5-6个CB和滑膜外植体被分配到每个处理条件。每2-3天更换一次培养基，持续2-4周。gydF4y2Ba

PTOA疾病模型(CBS+INJ)gydF4y2Ba

为了模拟pto -like机械创伤，使用一个培养箱装载装置对每个骨软骨塞的软骨表面进行单一的损伤性无侧限压缩[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．每个堵头首先固定在三个环内(两个泡沫，一个橡胶，1.5mm厚，内径4mm)(图4)。gydF4y2Ba1gydF4y2BaH)保持组织直立。插入环组件放置在定制的聚砜损伤/加载腔中，软骨表面朝上(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bai)，然后将腔体插入加载装置中(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baj).经过损伤性压缩(15mpa /s至峰值应力5MPa, 5MPa保持0.4 s，然后以15mpa /s卸载)后，从组件中取出插头，转移回培养基中，添加滑膜外植体，建立共培养疾病组(gydF4y2BaCBS + INJgydF4y2Ba)．每2 - 3天更换一次培养基，持续2周(补充图SgydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

用于化验的组织和废培养基样品gydF4y2Ba

每周收集组织样本(图SgydF4y2Ba1gydF4y2Ba)进行组织及生化化验。软骨和骨头被分离，称重，并立即冷冻。软骨组织消化液用于分析sGAG和胶原蛋白含量和生物合成速率(如下图)。在每次变化时收集的培养基用于评估硫酸盐GAG (sGAG)损失、单培养和共培养释放的炎症细胞因子浓度，以及单培养和共培养的细胞外代谢组学特征。gydF4y2Ba

软骨和骨骼的生存能力gydF4y2Ba

每周使用双乙酸荧光素/碘化丙啶(FDA/PI, Sigma)测定软骨在单培养和共培养中的活力[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．对于骨髓瘤，首先从骨下分离软骨;从软骨中心切开100-200μm厚的横切面(从上表面延伸至深部)，用FDA (4mg/ml)和PI (1mg/ml)处理2min, PBS冲洗2min。切片在蓝、绿滤镜下4倍放大(尼康荧光显微镜)，确定活细胞(绿色)和死细胞(红色)。MTT法测定骨组织活力(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑;西格玛M5655)方法[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．骨外植体在黑暗中37°C含5% CO的10ml 5mg /ml MTT无菌溶液中培养gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba观察代谢活跃的细胞形成福尔马赞所产生的紫色强度，以评估活力。gydF4y2Ba

炎症概要gydF4y2Ba

在第2、4、7、9、11和14天评估细胞因子在培养基中的组织释放情况。10种与人体关节损伤相关的细胞因子[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]，包括7个促炎因子(IL-1β， 1L-2, IL-6, IL-8, IL-12p70, IFN-γ， TNF-α)和3个抗炎因子(IL-4, IL-10, IL-13)。K15049D;Rockville, MD)能够从细胞培养上清中测量细胞因子，遵循制造商的说明。从5-6个技术重复中提取的废培养基样本将用于每个时间点，为每个供体在每个时间点创建一个样本。除IL-6和IL-8需稀释10倍外，汇集的样品均未稀释。gydF4y2Ba

组织学gydF4y2Ba

骨软骨组织在10%中性缓冲福尔马林中固定2天，脱钙，石蜡包埋，纵向切片;固定滑膜组织横切面。CB、CBS和CBS+INJ条件下的脱蜡和再水化骨软骨切片用苏木精和伊红(H&E -以评估结构和细胞)和甲苯胺蓝(以可视化软骨内sGAG的空间分布)进行染色。gydF4y2Ba

生化分析gydF4y2Ba

sGAG和总蛋白gydF4y2Ba

在培养基中添加20 μCi/ml，评价sGAG的合成和总蛋白的合成[gydF4y2Ba^35gydF4y2BaS]-硫酸，10 μCi/ml [gydF4y2Ba^3.gydF4y2BaH]-脯氨酸(Perkin Elmer, Norwalk, CT)分别作用24 H (gydF4y2BangydF4y2Ba= 3 /组)。洗4次去除游离标签后，将软骨与骨分离(共培养组)，取每个软骨和骨样本的湿重(WW)。骨组织首先在液氮中快速冷冻，然后立即粉碎成细粉末。骨组织粉和软骨用500 μl蛋白酶K溶液(2mg/ml in 50mM Tris-HCl, 1mM CaCl)消化gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， pH8)(罗氏，印第安纳波利斯，MN)在56°C保存16小时。[gydF4y2Ba^35gydF4y2BaS]硫酸和[gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba通过液体闪烁计数(Perkin Elmer)测量软骨消化物中H]-脯氨酸的掺入，并归一化为湿重量。采用二甲基亚甲基蓝(DMMB)染色结合法测定软骨组织消化物和废培养基中的sGAG含量[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．对组织消化物进行水解和干燥，用羟脯氨酸(OHP)测定法评估胶原蛋白的总含量[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba并归一化为湿权。gydF4y2Ba

ARGS-aggrecan和CTX-IIgydF4y2Ba

使用过的媒体样本(gydF4y2BangydF4y2Ba= 5-6个技术重复)从每个生物重复(gydF4y2BaNgydF4y2Ba= 3-6个供体)在第2天、第7天和第14天的时间点收集每种治疗条件的样本，为ARGS-aggrecan新表位和c -末端肽片段在每个时间点为每个供体创建一个样本gydF4y2Ba2gydF4y2Ba胶原蛋白(CTX-II)碎片。ARGS-aggrecan是一种软骨聚集酶降解的生物标志物，在Meso Scale发现平台上使用内部电化学发光分析方法对其进行了评估[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba];看到补充方法gydF4y2BaBgydF4y2Ba额外的细节。II型胶原蛋白(CTX-II)的c -末端肽片段是软骨降解的生物标志物，采用Sandwich-ELISA检测，检测说明(IDS, cat no。AC-08F1，盖瑟斯堡，马里兰州)[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．所有培养基样品在相同稀释倍数下重复进行。gydF4y2Ba

非靶向代谢组学的测量gydF4y2Ba

代谢组学研究的重点是循环代谢物，并使用捐赠者1-3号、7号、11-14号和16号的单培养和CBS共培养的废培养基样本进行。来自3个生物重复的废培养基样本用于11号和12号供体，而对于1-3号、7号、13-14号和16号供体，在培养第2天和第7天从多个孔收集废培养基，以关注循环代谢物的早期变化。样品被运送到美国人类代谢组技术公司(HMT;美国波士顿,MA)。使用前面描述的协议进行样品制备[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．采用毛细管电泳飞行时间质谱(CE-TOFMS)两种模式对阳离子和阴离子代谢物进行代谢组分析。根据HMT标准文库，共检测出116种代谢物。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

sGAG释放、胶原含量、sGAG生物合成和总蛋白的数据使用线性混合效应模型(以人类供体为随机因素)进行分析，随后使用Prism GraphPad进行Tukey的成对比较事后检验。对于细胞因子释放，使用供者匹配混合效应模型(REML)分析总释放量的组间差异(超过14天)。错误发现率(FDR, Benjamini-Hochberg方法)用于调整多次比较。对于ARGS-aggrecan和CTX-II释放，数据按治疗条件(C、CB、CBS、CBS+INJ)或天数分组[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba并用曼-惠特尼法进行分析gydF4y2BaUgydF4y2Ba(Wilcoxon秩和)的MATLAB检验。代谢组学数据分析采用主成分和层次聚类分析以及方差分析，以确定代谢产物水平的显著差异。gydF4y2BapgydF4y2Ba-值，或在某些情况下fdr调整gydF4y2BapgydF4y2Ba-值< 0.05，被认为有统计学意义(见补充表)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba5gydF4y2Ba更多细节)。gydF4y2Ba

文化建立和生存能力gydF4y2Ba

从人软骨、骨和滑膜组织中建立了可行的单培养和共培养。在供体组织中有代表性的活-死图像显示，在培养的前3周内，仅软骨和骨软骨栓中的软骨细胞死亡极少。gydF4y2Ba2gydF4y2BaA-h)，软骨细胞死亡通常局限于软骨浅表区。到第4周，包括C和CB在内的所有组均观察到软骨细胞死亡增加，这是即使在健康组织中也可以预料到的，因为体外培养的固有限制(包括营养可用性和废物交换有限，以及缺乏正常的机械力)(图4)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bad, h, l)。在CBS共培养中，大多数软骨细胞在第3周结束时死亡(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bak)。然而，与无机械损伤和炎症的单培养c相比，早在第1周，CBS+INJ培养中就观察到软骨细胞活力的最严重损失。由于机械损伤和滑膜共培养对软骨细胞活力有不利影响(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bam, n)， (CBS+INJ)治疗组仅研究2周。对滑膜组织的生存能力也进行了评估，包括单培养和CBS共培养;到第3周结束时，活细胞占优势，尽管一些死细胞分散在整个细胞中(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bap-r过程)。第4周观察到细胞死亡增加(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bas, w)。实验结束时，骨组织在MTT溶液中培养4小时，显示紫色染色，表明存在活细胞(数据未显示)。gydF4y2Ba

细胞因子的释放在包括滑膜在内的培养物中占主导gydF4y2Ba

使用16个供体的组织，测量不同治疗组在培养期间向培养基中释放的10种细胞因子(见表SgydF4y2Ba1gydF4y2Ba根据从每个膝盖上获得的可用组织对每个供体进行测试的治疗组列表)。一个代表性的例子(供体#7，图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba强烈提示细胞因子(IL-1β， IL-2, IL-12, IFNγ， TNF-α， IL-6, IL-8)主要通过包括滑膜(即gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba单一栽培,gydF4y2Ba哥伦比亚广播公司gydF4y2Bacoculture)。在CBS共培养中观察到的水平一般与滑膜单一培养相似，而在单独软骨培养中观察到的水平要低得多(gydF4y2BaCgydF4y2Ba)或骨软骨栓(gydF4y2BaCBgydF4y2Ba)．一个常见的情况是，细胞因子在第一周最初释放升高，随后在培养的其余时间下降到较低水平。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

然而，这些细胞因子的浓度在供体与供体之间差异很大，如图所示。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba所有供体在培养2周的所有时间点向培养基释放TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ。细胞因子的水平通常在培养的早期最高，但在一些供体中仍处于较高水平。TNF-α， CB vs CBS, CB vs CBS+INJ，gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0016和0.0105)滑膜组(S、CBS、CBS+INJ;统计分析汇总于表SgydF4y2Ba2gydF4y2Ba和SgydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)，而软骨单一培养(C)和骨软骨塞(CB)的水平较大多数供体低10 - 100倍(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

组织学观察gydF4y2Ba

组织学切片聚焦于单独培养2周的骨软骨栓的外观，比较共培养和机械损伤的效果。CB组软骨组织表面光滑，软骨结构基本完好(图1)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bad).可见一些细胞减少，这可能是由于桡骨周边表面暴露所致(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa, d)。相反，在CBS条件下，软骨表面出现明显损伤(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab, e)和CBS+INJ(图。gydF4y2Ba5gydF4y2BaC, f)，尤其是后者。CBS+INJ组织也有细胞减少的迹象，表现为大面积无细胞。CBS+INJ组软骨中间区肿胀，提示基质结构完整性缺失(图1)。gydF4y2Ba5gydF4y2Baf).仅在CBS+INJ组的少数样本中观察到垂直裂缝，由机械损伤引起(未显示)。在CBS培养中观察到软骨sGAG损失增加(甲苯胺蓝染色显示)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bah)与无滑膜的鼻梁软骨相比(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bag). sGAG损失在CBS+INJ中进一步加剧，在径向周围延伸到软骨深区更明显(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bai).从滑膜组织的纤维和脂肪形态中获得H&E切片，显示内膜层以及组织的深层(如图。gydF4y2Ba5gydF4y2BaJ, k)，但组间无显著变化。gydF4y2Ba

2周内sGAG和ARGS释放增加，但CTX-II释放不增加gydF4y2Ba

从组织学观察的空间方面定性地评估组织中GAG的总释放量(例如，图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bag-i)，也定量测量sGAG释放到培养基(使用DMMB法)从所有供体组织在所有时间点和培养条件，如表S所示gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．与C和CB相比，在CBS和CBS+INJ培养的14天内，累积GAG损失(占总初始组织GAG的百分比)通常更大。gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05;无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba) (gydF4y2BangydF4y2Ba=每个时间点5-6个技术重复;单培养C未在11号供体中检测)。在分析所有供体的GAG损失时，为了考虑供体的可变性，数据归一化为组织GAG含量(即任何时间点软骨中残留的GAG量归一化为当时的总GAG(软骨组织+培养基)(图1)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab).与C组或CB组相比，CBS组和CBS+INJ组组织GAG丢失加速，C组早在第2天就显著释放(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)和第4天CB (gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)(图gydF4y2Ba6gydF4y2Bab和补充表SgydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．第2天、第7天和第14天，在池化废培养基样品中测定释放到培养基中的args aggrecan片段的浓度，如图11所示(图11)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bac)，然后是所有供体(图5)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

虽然供体与供体之间存在相当大的差异，但与CB培养相比，CBS和CBS+INJ组ARGS-aggrecan片段的释放明显更大(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0011;gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)，早在第2天(统计分析汇总于补充表SgydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

sGAG和总蛋白的生物合成速率(通过放射标记掺入)在组间无显著差异(补充图SgydF4y2Ba2gydF4y2Baa、b)。gydF4y2Ba

在2周的培养过程中，两组间组织胶原蛋白总含量(羟脯氨酸)或释放的CTX-II片段水平无差异(补充图SgydF4y2Ba2gydF4y2Bac, d)。gydF4y2Ba

单一栽培具有明显的循环代谢特征gydF4y2Ba

单培养物的代谢特征和检测到的代谢物的组织特异性使用从1号、2号、3号和7号供体的软骨、骨和滑膜单培养物的第2天和第7天收集的废培养基样本进行研究。主成分分析(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Baa)和层次聚类分析(图5)。gydF4y2Ba7gydF4y2BaB)在多供体数据集上进行的研究表明，软骨和骨骼样本更紧密地聚集在一起，而滑膜样本则分别聚集在一起，并显示出更高的供体变异性。基于方差分析结果，我们发现34种代谢物的相对丰度差异在单一栽培品种之间具有统计学意义，并且每个单一栽培品种的代谢物图谱随着时间的推移基本保持保守(图1)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bac).一组代谢物在滑膜中富集，而在软骨或骨样本中检测到的水平较低，表明这些循环代谢物对滑膜组织的特异性。在软骨和骨样品之间有显著差异的9种代谢物中，三种TCA循环化合物柠檬酸、异柠檬酸和顺乌头酸在软骨样品中被消耗殆尽。gydF4y2Ba

在骨软骨组织培养中滑膜诱导炎症反应gydF4y2Ba

为了进一步研究滑膜对骨软骨栓的影响，我们比较了1号、7号、11号和16号供体的CB和CBS共培养中测定的循环代谢物。四种代谢物在CBS组中显著改变(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)(图gydF4y2Ba8gydF4y2Baa).与CB组相比，CBS组的Kynurenine、1-甲基烟酰胺和乳酸水平升高，而亮氨酸水平降低(图1)。gydF4y2Ba8gydF4y2Bab). kynurenine通路(图。gydF4y2Ba8gydF4y2BaC)受炎症细胞因子调控，与炎症性神经疾病有关[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba风湿性关节炎和骨质疏松症[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．连接到kynurenine通路，烟酰胺代谢(图。gydF4y2Ba8gydF4y2Bac)也与类风湿性关节炎(RA)有关，并可能与慢性炎症有关[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．当分离培养条件和时间的影响时，结果表明1-甲基烟酰胺、kynurenine和次黄嘌呤仅在培养条件下发生显著变化，而乳酸水平的变化也随着时间的推移而显著变化(图2)。gydF4y2Ba8gydF4y2Bad).乳酸和次黄嘌呤在缺氧下都升高，表明组织损伤[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

为了研究改变代谢物的组织特异性，我们比较了来自捐献者1号、2号、3号和7号的软骨、骨和滑膜单一培养的废培养基样品中的测量水平。与CBS组测量的升高一致，滑膜样品中kynurenine, 1-甲基烟酰胺和次黄嘌呤水平明显高于软骨和骨单培养(补充图SgydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．虽然没有达到统计学意义，但与软骨和骨骼相比，滑膜样品的平均乳酸水平趋于升高，Leu水平趋于降低，这与观察到的CB组和CBS组的变化一致。gydF4y2Ba

据我们所知，这是第一个将人类膝关节骨软骨塞与取自同一供体膝关节的滑膜外植体共培养并结合骨软骨塞软骨表面撞击损伤的体外模型，所有这些都有助于研究PTOA的起始和早期进展途径。该模型允许软骨、骨和滑膜在2周的培养期内相互作用，以及机械损伤和炎症的综合作用。我们假设，利用无已知关节疾病病史的供体组织的模型可以揭示组织特性的早期变化，并突出生物化学和代谢物生物标志物的早期变化。然后可以将这些事件与患者来源的滑膜液标记物进行比较[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba以及关节损伤后不久的临床观察[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．这种模型还可用于研究潜在的治疗方法和损伤后尽快将药物输送到特定组织的适当方法[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

我们观察到，与cb对照相比，在CBS和CBS+INJ共培养的2周内，ARGS-aggrecan片段和相关sGAG释放到培养基中立即增加(图1)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,表gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和SgydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．这与主要来自滑膜的炎症细胞因子的立即释放有关(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．撞击损伤和炎症共同加剧了存活软骨细胞的损失，这是pto样进展的一个重要早期组成部分[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．从软骨、骨和滑膜单一培养物中释放的独特代谢物，以及一组循环代谢物，也表明滑膜诱导骨软骨组织的炎症反应(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

由于关节外伤常对软骨造成损伤性机械冲击[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]，我们在CBS+INJ治疗中纳入了临床相关的骨软骨栓压迫。许多组使用的有害压缩体外模型涉及峰值应力或峰值应变的规范，以及加载速率[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．由于软骨厚度在我们完整的骨软骨塞之间是不同的，因此在培养环境中控制每个单独的软骨塞的峰值应变是不可行的;因此，我们施加了峰值压力。施加的加载速率也非常重要:当加载缓慢时，由于流体运动和基质分子的重新排列(即孔隙弹性弛豫)，软骨组织在内部重新分配负载[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]，从而防止损伤关节面。然而，当加载速率远远高于流体基质孔隙弹性再分配时间时，流体压力和机械应力会在内部积聚，这可能导致广泛的细胞死亡和结构组织损伤。综上所述，我们发现当加载速率为15 MPa/s，峰值应力为5 MPa时，可以成功地模拟表面区域细胞死亡的增加(图1)。gydF4y2Ba2gydF4y2BaM, n)无明显损伤，与以往使用人类膝关节软骨外植体的体外损伤研究结果相似[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]和成年牛骨软骨栓[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]，以及前交叉韧带破裂后患者源性骨软骨活检的观察[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．仅在少数样本中观察到软骨结构变化为椭球状或裂隙状外观，这与先前对这些有害加载条件的观察一致[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．然而，即使在体外或体内前交叉韧带损伤后软骨没有明显的视觉损伤[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]，这种损伤性压迫可诱发软骨基质内的微损伤，可增强炎性细胞因子从周围基质(或滑膜液)进入软骨的运输，从而加速基质分解代谢[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

PTOA是一种多组织疾病，滑膜巨噬细胞、滑膜细胞和软骨细胞都能表达和分泌一系列炎症因子[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．在我们的研究中，我们发现在2周的共培养过程中滑膜是炎症细胞因子的主要组织来源。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)，与已知的人类创伤性膝关节损伤后滑膜炎症和滑膜炎的中心作用一致[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．我们观察到在CBS和S外植体培养中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8、IFNγ、IL-12和IL-13以及IL-4、IL-10和IL-2立即释放(如图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．我们注意到，将滑膜切成4 - 5毫米的全厚度外植体可能构成切边的部分损伤，部分原因可能是炎性细胞因子释放增加。来自所有供体的2周S、CBS和CBS+INJ外植体培养中IL-1β、TNF-α、IL-6和IFNγ的浓度明显高于C或CB培养(图4)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．重要的是，与参考(非受伤)受试者相比，acl损伤患者的滑液中IL-6、TNF-α、IL-8、IFNγ和IL-10浓度在损伤后的头几天和几周内也显示出统计学上显著升高[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．有趣的是，在我们的CBS和CBS+INJ治疗中，IL-6的浓度通常比任何其他细胞因子的浓度高100倍左右。IL-6的释放在acl损伤的滑液中也有显著增加，与未损伤的膝关节相比，IL-6的释放量高达1000倍[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]，进一步支持了我们的CBS和CBS+INJ治疗模型与人类关节损伤的相关性。同时，很明显，在释放的细胞因子水平上，供者与供者之间存在显著的差异。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．除了关节软骨的机械性损伤和骨的损伤外，膝关节其他相关组织的创伤性损伤，如前交叉韧带破裂和半月板撕裂，也与发生OA的风险密切相关[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．然而，这些组织超出了本研究的范围，部分原因是为了限制这里开发的模型的复杂性和混杂变量的存在。在未来的研究中，也可以探索从供体膝关节中获得滑膜液样本的可能性，以建立膝关节中细胞因子和代谢物的基线水平。gydF4y2Ba

众所周知，人类创伤性膝关节损伤会导致释放到滑膜液的蛋白酶和软骨基质碎片水平升高，与基质降解有关[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba包括增加GAG损失。我们看到，在与滑膜(炎症介质的来源)共培养以及滑膜和机械损伤软骨结合后，软骨sGAG的损失立即增加。早在第2天，CBS组和CBS + INJ组相应的组织GAG含量显著降低。与参考受试者相比，在前交叉韧带破裂后的几天内，受伤膝关节的滑液中已观察到ARGS-aggrecan的快速释放[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．我们还观察到，在共培养的第2天和第7天，与CB对照组相比，CBS组和CBS+INJ组的培养基中ARGS新表位片段的释放明显更高(图1)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bad)，对应于这些治疗组的聚合酶活性(以及相应的累积GAG损失(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab))。同时，我们没有检测到CTX-II片段释放增加(图SgydF4y2Ba2gydF4y2Bad)在CBS培养中或总胶原蛋白损失增加(图SgydF4y2Ba2gydF4y2Bac)在CBS和CBS+INJ培养基中。虽然有报道称前交叉韧带破裂后的尿液样本中存在CTX-II，但这可能与钙化软骨和骨的转变更密切相关，而与透明软骨的转变无关[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．在我们的体外研究中，胶原分解标记物的延迟出现可能反映了关节损伤后软骨蛋白水解的早期特征及其伴随的生物标记物释放到滑膜液的动力学。先前对用外源性细胞因子挑战的分离软骨外植体的研究同样表明，胶原蛋白网络的降解和丢失直到聚集蛋白组分显著丢失才开始，聚集蛋白的存在可能保护软骨胶原蛋白不被蛋白质水解[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba］．因此，聚aggrecan蛋白水解可能是pto -a相关软骨破裂的最早事件(和治疗靶点)之一。gydF4y2Ba

了解骨关节炎的代谢变化有助于发现生物标志物，并支持疾病缓解药物的开发。我们将重点放在循环代谢物上，对PTOA的早期生物标志物候选物进行调查，以了解疾病的起始和进展。利用患者滑膜组织进行的各种代谢组学研究[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba，滑液[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba，或血清[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]样本提供了广泛的知识和诊断标志物候选，如血清支链氨基酸与组氨酸的比值。然而，由于疾病的异质性和患者的可变性，OA的代谢物改变或分子特征没有完全一致的说法。尽管如此，这些研究中的大多数都指出了一种与缺氧、炎症和高能量需求相关的生化特征，这是由观察到的代谢途径的扰动所暗示的[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba］．与这些研究一致，我们的结果显示代谢产物的改变与缺氧和炎症有关，除了干扰氨基酸代谢。以往骨关节炎代谢组学研究的常见局限性，如使用动物模型或缺乏平衡的患者群体，通过使用多个既往无骨关节炎病史的供体的人体组织培养，在本研究中得到了缓解。尽管如此，我们的结果显示了供体的差异性，并提示了一些代谢物的供体特异性，如kynurenine，在CBS和CBS+INJ中升高，但在一些供体中未检测到。gydF4y2Ba

本研究的局限性集中在供体的可获得性和可从任何单个供体关节中获得的CB和S样本的总数。PTOA的早期阶段被认为是由最初的机械损伤伴随炎症细胞因子释放到浴滑液引起的。因此，在我们最初的一系列实验来表征单培养后，我们的共培养实验设计聚焦于CBS+INJ条件作为pto - a疾病环境的最接近代表，在每个研究时间点，每个可用的膝盖需要5-6个技术重复(组织)。由于样本总数的限制，我们不能进行尽可能多的cbs单独治疗，也不能测试损伤单独条件进行比较(例如，CB+INJ)，特别是由于一些检测(例如，组织病理学，生物化学)是破坏性的，这需要针对每个研究时间点单独的组织组。供体的可变性可以通过释放的细胞因子浓度的测量值的广泛范围来举例说明。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)和aggrecan ARGS新表位片段(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Bad).供体变异可能也是GAG和总蛋白生物合成值传播的潜在原因(图SgydF4y2Ba2gydF4y2BaA, b)，没有观察到趋势。然而，这种变化是患者的临床研究固有的，包括那些持续的前交叉韧带损伤。的确，雅各布斯等人。gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]发现与滑膜液细胞因子、降解酶和软骨降解生物标志物水平相关的单独的高(“失调”)和低炎症反应簇;这种可变性不是损伤严重程度的函数。因此，体外组织中供体与供体之间的差异可能反映了不同患者膝关节组织之间类似的差异性。需要进一步的研究来确定年龄、性别和初始组织分级是否是这些差异的决定因素。gydF4y2Ba

尽管存在这种差异性，但我们发现，使用模拟人类关节中骨软骨组织和滑膜之间关系的共培养模型，我们观察到滑膜组织产生的关键早期炎症反应标记物。这些标志物包括多种细胞因子和代谢产物，可能在PTOA的发病机制中发挥作用。数据进一步证明，这些滑膜产物促进关节软骨退化。这种退化是附加在软骨细胞和细胞活力的损失造成的伤害性压迫。有趣的是，可用的数据比较gydF4y2Ba哥伦比亚广播公司gydF4y2Ba而且gydF4y2BaCBS + INJgydF4y2Ba培养几乎没有证据表明滑膜炎症标志物和损伤性压迫之间的协同作用促进软骨退化。这可能反映了在这些实验中所代表的疾病过程的非常早期的阶段。然而，最近对疾病生物标志物释放动力学的蛋白质组学研究[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]也表明，单一的机械撞击损伤会比单纯炎症引起的基质破坏早几天开始。这可能与基质损伤诱导的微损伤有关，从而增强了介质进入软骨的运输，并随后释放基质分解产物。gydF4y2Ba

本文开发和研究的新型骨软骨-滑膜共培养模型与其他PTOA模型相比具有许多优点。使用来自既往无OA病史供体的人类膝关节组织表明该模型与PTOA进展的早期阶段相关。特别是CBS+INJ系统，显示出与pto -like的起始和进展相关的明显的细胞、炎症和基质相关的改变。人类滑膜的使用提供了细胞因子和代谢物的内源性来源，而不是提供了不可能复制滑膜生产的外源性炎症分子的预先确定的鸡尾酒。此外，采用维持关节软骨与软骨下骨附着的人骨软骨样本的模型，可以更好地模拟体外机械应力的大小和分布，以及负载参数与细胞对创伤反应之间更好的相关性。正在使用这种共培养模型进行的研究包括质谱蛋白质组学分析、地塞米松和胰岛素样生长因子-1对疾病改变的影响的研究，以及在国际空间站发现的近地轨道辐射和微重力的影响。gydF4y2Ba

所有数据均包含在本稿件和补充材料中。这些数据也将公布在我们实验室的网站上。gydF4y2Ba

史:gydF4y2Ba

滑膜gydF4y2Ba

C:gydF4y2Ba

软骨gydF4y2Ba

CB:gydF4y2Ba

Cartilage-bone coculturesgydF4y2Ba

哥伦比亚广播公司:gydF4y2Ba

Cartilage-bone-synovium coculturesgydF4y2Ba

CBS + INJ:gydF4y2Ba

软骨-骨-滑膜与机械损伤软骨共培养gydF4y2Ba

ACL:gydF4y2Ba

前交叉韧带gydF4y2Ba

PTOA:gydF4y2Ba

创伤后关节炎gydF4y2Ba

MPa:gydF4y2Ba

兆帕gydF4y2Ba

办公自动化:gydF4y2Ba

骨关节炎gydF4y2Ba

类风湿性关节炎:gydF4y2Ba

类风湿性关节炎gydF4y2Ba

sGAG:gydF4y2Ba

硫酸粘多糖gydF4y2Ba

DMMB:gydF4y2Ba

Dimethylmethylene蓝色gydF4y2Ba

IL:gydF4y2Ba

白介素gydF4y2Ba

肿瘤坏死因子α:gydF4y2Ba

肿瘤坏死因子αgydF4y2Ba

干扰素γ:gydF4y2Ba

干扰素γgydF4y2Ba

食品药品监督管理局:gydF4y2Ba

荧光素二乙酸gydF4y2Ba

PI:gydF4y2Ba

Propidium碘化gydF4y2Ba

麻省理工:gydF4y2Ba

(3) - 4 5-Dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyltetrazolium溴离子gydF4y2Ba

):gydF4y2Ba

苏木精和伊红gydF4y2Ba

形成:gydF4y2Ba

羟脯氨酸gydF4y2Ba

CTX II:gydF4y2Ba

II型胶原蛋白的c末端肽片段gydF4y2Ba

CE-TOFMS:gydF4y2Ba

毛细管电泳飞行时间质谱gydF4y2Ba

我:gydF4y2Ba

吲哚胺2,3-dioxygenasegydF4y2Ba

TDO:gydF4y2Ba

色氨酸2,3-dioxygenasegydF4y2Ba

AFMID:gydF4y2Ba

ArylformamidasegydF4y2Ba

KYNU:gydF4y2Ba

犬尿氨酸酶gydF4y2Ba

凯特:gydF4y2Ba

犬尿氨酸/ 2-aminoadipate转氨酶gydF4y2Ba

K3H:gydF4y2Ba

犬尿氨酸3-monooxygenasegydF4y2Ba

3-HAO:gydF4y2Ba

4-dioxygenase 3-Hydroxyanthranilate 3日gydF4y2Ba

NNMT:gydF4y2Ba

烟酰胺N-methyltransferasegydF4y2Ba

作者感谢希望的礼物器官和组织捐赠网络(Itasca, IL);国家疾病研究交流中心(NDRI)，费城，宾夕法尼亚州;以及弗吉尼亚州弗吉尼亚海滩的LifeNet Health;和捐赠者的家属。我们也感谢韩华雄和Emily Geishecker的贡献。gydF4y2Ba

NIH-NCATS基金UG3/UH3 TR002186 (AJG)资助;Rush Klaus Kuettner捐赠主席(SC);美国退伍军人事务部和印第安纳大学医学院(SBT)。gydF4y2Ba

作者和联系gydF4y2Ba

1. 麻省理工学院生物工程系，剑桥，马萨诸塞州，美国gydF4y2Ba

   Garima Dwivedi, Lisa Flaman, Begum Alaybeyoglu, Eliot H. Frank & Alan J. GrodzinskygydF4y2Ba

2. 发育生物学系，哈佛牙科医学院，波士顿，马萨诸塞州，美国gydF4y2Ba

   Garima Dwivedi & Vicki RosengydF4y2Ba

3. Javelin Biotech, Woburn, MA, USAgydF4y2Ba

   Begum Alaybeyoglu和Murat CiritgydF4y2Ba

4. 瑞典隆德大学医学院隆德临床科学系矫形外科gydF4y2Ba

   安德烈StruglicsgydF4y2Ba

5. 美国伊利诺斯州芝加哥拉什大学医学中心儿科、骨科和内科(风湿病科)gydF4y2Ba

   苏珊ChubinskyagydF4y2Ba

6. 印第安纳大学医学院整形外科，印第安纳波利斯，美国gydF4y2Ba

   斯蒂芬·b·TrippelgydF4y2Ba

7. 美国麻省理工学院电气工程与计算机科学系gydF4y2Ba

   艾伦·j·GrodzinskygydF4y2Ba

8. 麻省理工学院机械工程系，NE47-377, 500技术广场，剑桥，02139，美国gydF4y2Ba

   艾伦·j·GrodzinskygydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

学习GD、BA、AS、VR、MC、ST、AJG的概念和设计;通过GD、LF、BA、AS、EF、MC、VR、AJG等软件进行数据采集、分析和解释;EF、AS、VR、ST、SC和MC的主题专业知识;由SC提供学习资料;GD、BA、AJG负责初稿准备工作。所有作者审阅并批准了手稿的最终版本。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba艾伦·j·GrodzinskygydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

所有的实验过程都得到了麻省理工学院人体实验委员会的批准。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

该手稿此前没有在其他地方发表过，也没有考虑在其他期刊上发表。所有作者同意在gydF4y2Ba关节炎的研究与治疗gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者声明他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

卡塔尔世界杯常规比赛时间施普林格自然对出版的地图和机构附属的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循创作共用署名4.0国际许可协议(Creative Commons Attribution 4.0 International License)，该协议允许在任何媒体或格式中使用、分享、改编、分发和复制，只要您给予原作者和来源适当的署名，提供创作共用许可协议的链接，并说明是否有更改。本文中的图片或其他第三方材料包含在文章的创作共用许可中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料不包含在文章的创作共用许可中，并且您的预期用途不被法律法规允许或超出了允许的用途，您将需要直接从版权所有者那里获得许可。欲查看此许可证的副本，请访问gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用公共领域奉献放弃书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本文提供的数据，除非在数据的信用额度中另有说明。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba