自体蛋白溶液处理改变淋巴细胞和髓细胞群，调节依赖于细胞类型的基因表达gydF4y2Ba

骨关节炎(OA)是一种退行性疾病，与软骨退化、骨赘形成和纤维性颤动有关。自体蛋白溶液(APS)是一种自体抗炎矫正生物制剂，用于OA的疼痛管理和治疗。各种自体PRP配方的组成物，由于其最少的加工过程和生物活性分子的来源，在临床中用于肌肉骨骼病理。目前，对于复杂混合物的最佳组成还没有共识。在本研究中，我们集中在阐明APS的免疫细胞亚型和表型。我们鉴定了健康供体黄芪多糖中的免疫细胞类型，并研究了黄芪多糖加工后免疫细胞的表型变化。通过流式细胞术分析，我们发现APS中最丰富的免疫细胞类型是中性粒细胞和T细胞，而单核细胞的浓度成倍变化最大。基因表达谱显示，APS处理会导致依赖于免疫细胞类型的差异基因表达变化，其中差异调节最显著的基因发生在单核细胞中。我们的研究结果表明，血液的机械加工，其主要目的是富集和分离，可以改变其蛋白质和细胞组成，以及最终产品的细胞表型。gydF4y2Ba

血液来源疗法提供高浓度的自体有丝分裂和趋化细胞因子和生长因子。自体富血小板血浆(PRP)疗法，一种血液来源疗法或自体原位生物疗法，由大部分浓缩血小板组成，在肌肉骨骼系统的慢性病理中有广泛的临床应用。PRP含有不同浓度的血小板、白细胞、红细胞、凝血因子、生长因子、生物活性蛋白、rna和脂类。PRP含有血小板衍生生长因子- bb、转化生长因子-β1、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞因子、内皮生长因子、胰岛素样生长因子-1等1500多种生物活性因子[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．据称，PRP的主要作用模式是由于分泌颗粒激活血小板时释放的生长因子和激素的超生理浓度，其中最丰富的是α-颗粒，可以改变分解代谢环境，随后调节局部修复和再生过程[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．非血小板细胞在PRP治疗中的作用尚未完全了解。已知的非血小板细胞在伤口愈合中的功能可能在PRP的作用模式中发挥作用。伤口愈合级联受到严格调控，需要血液中所有成分的协调，非血小板细胞如粒细胞和单核细胞在释放因子、细胞募集和促进细胞表型变化中发挥作用。gydF4y2Ba

膝骨关节炎(OA)是一种退行性多因子疾病，是关节炎最常见的形式。膝骨性关节炎的特征是关节疼痛和结构变化，包括僵硬、滑膜炎症和纤维化、软骨侵蚀、软骨下骨改变、骨赘形成，并可导致关节失去活动能力。病变关节内的慢性低级别炎症和分解代谢微环境有助于骨关节炎的进展，并由细胞因子、趋化因子和蛋白水解酶驱动。促炎细胞因子，白细胞介素-1β (IL-1β)和肿瘤坏死因子-α (TNF-α)可以通过增加成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)中的一氧化氮和活性氧(ROS)诱导关节分解代谢。IL-1β和TNF-α可促进ecm降解酶和抑制剂的产生，从而导致进一步的软骨破坏和OA疾病的进展[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ，gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．膝骨性关节炎是一种复杂的疾病，包括支持细胞和效应细胞类型(如内皮细胞、FLS、巨噬细胞和T细胞)之间的多种相互作用和串扰。这种复杂性需要一种多功能治疗，它可以作用于疾病进展的各种模式，如免疫调节、抑制炎症和软骨细胞/成纤维细胞重编程。虽然有从非药物方法到外科手术的治疗选择;疼痛管理和治疗仍然是临床需要未得到满足的重要领域。临床前和临床研究支持使用正畸生物制剂，包括PRP治疗膝骨性关节炎[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．像PRP这样的正畸生物疗法是微创的，成本有限。临床证据的系统综述表明，基于多个验证的结果评分(西安大略和麦克马斯特大学骨关节炎指数或Lequesne指数;膝关节损伤与骨关节炎预后评分量表(OMERACT-OARSI) [gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ，gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．随机对照试验(rct)的meta分析广泛评价PRP治疗膝骨性关节炎与盐水或其他关节内治疗(如透明质酸和类固醇注射)的比较发现，PRP注射比其他注射提供更好的临床结果，其临床效益随着时间的推移而增加[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．gydF4y2Ba

利用不同的处理技术，可以从全血中制备出不同的PRP成分的自体疗法。PRP可分为纯PRP、低白细胞PRP或富白细胞PRP，但尚不存在标准的分类体系[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．患者的差异性和不同的处理技术可导致PRP中血小板水平、血小板激活率和生长因子谱的不同[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．此外，患者的差异性可能源于现有共病、性别、年龄和生活方式的差异。这些因素可能影响PRP治疗的功能能力。由于血小板浓度、功能和生物活性因子浓度的昼夜变化，采血时间也可能影响PRP的组成[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ，gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．到目前为止，还没有关于骨关节炎治疗所需的PRP成分或注射次数的治疗相关指南。对于使用含有白细胞的PRP治疗肌肉骨骼疾病，目前尚无共识和有限的临床证据。一些研究发现，白细胞的添加会导致短暂的炎症和患者不适，这在一定程度上可能是由于粒细胞释放的蛋白酶和活性氧(ROS)的破坏性作用[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ，gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．其他研究表明，白细胞可能对疾病治疗所需的合成代谢环境没有贡献[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．相反，其他人注意到白细胞是伤口愈合所需的重要细胞因子和酶的来源[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．需要进一步的临床评价来了解白细胞对PRP治疗的贡献。gydF4y2Ba

nSTRIDE®自体蛋白溶液(APS)，在动物健康中也被称为Pro-Stride APS，是一种用于疼痛管理和OA治疗的自体疗法。APS的临床前研究和表征已经证明其能够调节炎症反应和减少软骨降解[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．黄芪多糖由白细胞、血小板和浓缩血浆组成。先前对黄芪多糖的研究表明，与全血相比，黄芪多糖具有丰富的抗炎细胞因子和合成代谢生长因子，如IL-1Ra、sIL-1RII和sTNF-R1 [gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．迄今为止，一项单次注射黄芪多糖治疗OA的临床试验表明，与基线相比，疼痛有显著改善，且黄芪多糖的安全性与盐水治疗组相当[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ，gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．除了在PRP治疗中广泛存在的抗炎细胞因子和合成代谢生长因子的治疗重要性外，体外研究发现，当白细胞存在于原位生物细胞[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．基于PRP组成的血小板脱颗粒的差异表明，脱颗粒过程是复杂的，有多种因素可以影响脱颗粒的程度。白细胞可提供重要的细胞内因子如IL-1Ra，影响生物活性分子的脱颗粒，产生趋化因子/细胞因子，并可调节免疫反应。这些结果为进一步研究APS中的白细胞组成和细胞表型提供了依据。gydF4y2Ba

在目前的研究中，我们调查了APS中的免疫细胞和蛋白质组成，并探讨了注射前处理可能如何影响健康供体的细胞表型和基因表达。我们发现APS处理富集了CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba免疫细胞，中性粒细胞和T细胞是最终产物中数量最多的免疫细胞类型。与白细胞相比，单核细胞的富集变化最高。APS处理维持了抗炎CD163的优势gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在wbc中发现经典单核细胞和非经典单核细胞的亚群。利用多重基因表达试验对免疫亚群进行基因表达谱排序。由于APS处理，单核细胞发生了显著的基因表达变化，与抗原处理和呈递相关的基因表达存在差异。一项使用创伤后骨关节炎(pita)模型的体内小鼠研究用于评估APS免疫细胞成分的持久性。研究发现，免疫细胞持续存在，表明非血小板细胞可以提供持久的线索和可溶性因子，超过最初的注射。gydF4y2Ba

APS处理丰富了多种免疫细胞群的免疫浓度gydF4y2Ba

我们对从4名健康献血者获得的血液中经过APS处理后的免疫细胞群进行了特征分析。gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 a.采用流式细胞术研究APS中存在的免疫细胞类型;我们定义中性粒细胞群体(CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD3gydF4y2Ba^−gydF4y2BaCD15gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)、单核细胞(CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD3gydF4y2Ba^−gydF4y2BaCD15gydF4y2Ba^−gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba^{昏暗的gydF4y2Ba})、自然杀伤细胞(NK)细胞(CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD3gydF4y2Ba^−gydF4y2BaCD15gydF4y2Ba^−gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba^−gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba^+gydF4y2BaHLAgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba)、NKT细胞(CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD3gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba^−gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)和T细胞(CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD3gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba^−gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba)，门控策略如图S所示gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 a. APS处理导致CD45显著富集5倍gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba与wbc相比，保持细胞活力的同时免疫细胞。gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 b).中性粒细胞(2400万±1100万细胞/mL)和T细胞(980万±690万细胞/mL)是APS中最丰富的免疫细胞类型，其次是经典单核细胞(190万±100万细胞/mL)、NK细胞(160万±80万细胞/mL)和NKT细胞(140万±110万细胞/mL)(图4)。gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 c).与白细胞相比，APS中中性粒细胞、经典单核细胞和NK细胞明显富集。其他免疫细胞类型在处理后富集，且呈现较低浓度，包括非经典单核细胞(CD45)gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD3gydF4y2Ba^−gydF4y2BaCD15gydF4y2Ba^−gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba^{昏暗的gydF4y2Ba}CD16gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)，树突状细胞(CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD3gydF4y2Ba^−gydF4y2BaCD15gydF4y2Ba^−gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba^-gydF4y2BaHLAgydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba^−gydF4y2BaCD11cgydF4y2Ba^+gydF4y2BaHLAgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)和嗜酸性粒细胞(CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD3gydF4y2Ba^−gydF4y2BaCD15gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba)(图。gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 a - b)。APS处理后嗜酸性粒细胞明显富集。gydF4y2Ba

然后我们探讨了供体的可变性。供体样品当天处理，在同一台细胞仪相同设置下进行流式细胞术实验。正向散点图和侧散点图显示了供体之间相同免疫细胞类型的差异，这表明供体之间存在差异(图1)。gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 a)捐献者之间的亚人群有明显的变化。经典单核细胞(CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD3gydF4y2Ba^−gydF4y2BaCD15gydF4y2Ba^−gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba^{昏暗的gydF4y2Ba}(灰色)相对于白细胞，在APS中更丰富，并在正向和侧散点图中在不同供体之间转移。中性粒细胞(CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD3gydF4y2Ba^−gydF4y2BaCD15gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba特别是，在大小和粒度方面，志愿者之间有很大的差异。炎症过程中由于密度变化引起的粒细胞之间的转移提示激活状态、成熟状态和肉芽形成的差异[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ，gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．总的来说，与白细胞相比，APS处理后，单核细胞(数量是白细胞的16倍)，其次是中性粒细胞(数量是白细胞的6倍)，在免疫细胞群中发生了最大的成倍变化(图1)。gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 d)。gydF4y2Ba

APS处理后免疫细胞亚型差异基因表达的显著变化与免疫细胞类型相关gydF4y2Ba

我们对粒细胞(CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD11bgydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD3gydF4y2Ba^−gydF4y2BaCD15gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba)、T细胞(CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD3gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD11b)和单核细胞(CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD3gydF4y2Ba^−gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD15gydF4y2Ba^−gydF4y2BaCD11bgydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD11cgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)来评估机制通路活性(FACS门控策略如图S所示gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 )．为了评估与先天和适应性免疫反应相关的基因表达变化，我们使用panccancer免疫分析编码集进行了纳米串多重基因表达检测。数据分析采用ROSALIND平台(gydF4y2BapgydF4y2Ba_{邻接的gydF4y2Ba}< 0.05, 1.5≤LFC≤−1.5)，分析显示APS与wbc的差异变化取决于细胞类型。ROSALIND平台是一个基于云的基因表达数据分析软件平台。与分析的基因相比，APS处理后的T细胞基本不受影响，与从白细胞中分离的T细胞相比，没有明显的基因表达差异gydF4y2Ba．gydF4y2BaAPS处理后骨髓腔室发生明显变化;109和4个基因分别从排序的单核细胞和粒细胞中差异调控(图。gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 e).分选粒细胞中差异调节基因与抗原处理相关(gydF4y2BaTap1gydF4y2Ba)及炎症反应(gydF4y2BaMapkapk2gydF4y2Ba，gydF4y2BaPtgs2gydF4y2Ba)(图。gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 c).我们利用STRING构建差异调控基因的蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction, PPI)网络。利用KEGG通路数据库，我们发现VEGF信号通路的功能富集(gydF4y2BaMapkapk2, Ptgs2gydF4y2Ba)和c型凝集素受体(CLR)信号通路(gydF4y2BaMapkapk2gydF4y2Ba，gydF4y2BaPtgs2gydF4y2Ba)．VEGF信号通路在白细胞募集中发挥重要作用，通过促进内皮细胞增殖和血管生成参与创面愈合级联，而CLRs可控制适应性免疫。基因表达的差异，特别是在APS处理后的单核细胞中发现的基因表达差异，可能提示功能变化可能影响治疗结果。值得注意的是，所有来自分类免疫细胞的差异表达基因均上调，表明APS处理后存在极化反应。gydF4y2Ba

为了探索APS处理对免疫细胞类型的影响，我们创建了纳米串数据的不同可视化。Nanostring数据的样本相关性热图强调，无论APS处理如何，从wbc和APS中分类的T细胞和颗粒细胞具有很强的相关性，而从APS或wbc中分类的单核细胞相关性较低(图SgydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 d).样本相关性热图是数据的图形表示，其中单个相关性值(用颜色表示)包含在一个暗红色对应强相关性(接近1)的矩阵中。这一趋势进一步得到了排序细胞类型之间表达差异的多维标度(MDS)图的支持，其中T细胞和来自APS和wbc的粒细胞聚集得更近，表明基因表达的相似性。而来自APS和wbc的单核细胞并不聚集在一起(图SgydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 e). MDS图坐标1按细胞类型区分，坐标2按处理方法对样本进行分层。在检测的770个基因中，这些数据表明APS处理对单核细胞基因表达的改变比T细胞或粒细胞更大。这种改变可能与APS治疗过程中单核细胞活性有关。gydF4y2Ba

APS处理丰富了单核细胞中m2样显性表型gydF4y2Ba

我们用流式细胞仪研究APS处理后的单核细胞表型。在这里，APS处理后单核细胞表型的变化首先使用M1- (CD80)和m2样(CD163)表型的巨噬细胞极化标记来近似，尽管这种分类的简化并没有解决可能存在的异质性和复杂性。wbc和APS样品中CD80和CD163的平均荧光强度(MFI)值具有可比性。CD163的MFI值高于CD80的MFI值，这表明在APS处理之前，白细胞中的单核细胞存在m2样的倾斜表型(图1)。gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 a). wbc和APS样品中MHC-II的MFI值也具有可比性。APS处理导致CD163显著富集gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba两种经典单核细胞的数量从158,000±113,000 cells/mL增加到174万±100 million cells/mL。APS处理后，非经典单核细胞CD163gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba从5200±3000 cells/mL增加到68700±66,000 cells/mL。双重否定,CD80gydF4y2Ba^−gydF4y2BaCD163gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba非经典单核细胞从10,300±6500细胞/mL增加到102,000±114,000细胞/mL(图1)。gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 b)。CD163gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba表达是由抗炎介质诱导的，在化解炎症中很重要。CD163的表达也可能提示体内平衡、调节或免疫维持规划[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ，gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．其他单核细胞亚群的浓度较小，在APS处理后没有显著富集(图SgydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 一个)。gydF4y2Ba

为了进一步表征单核细胞，我们评估了CD163的百分比gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和CD80gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在经典(CD14gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba^{昏暗的gydF4y2Ba})和非经典单核细胞(CD14gydF4y2Ba^{昏暗的gydF4y2Ba}CD16gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)．CD163gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD80gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba为APS和wbc中经典单核细胞的优势亚型，分别为93.3%和92.3%，而大多数非经典单核细胞为双阴性，分别占APS和血液中数量的58%和66%(图1)。gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 c). CD80双阳性较少gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD163gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和CD80gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD163gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba经典单核细胞和非经典单核细胞。APS处理导致经典单核细胞(CD163)中m2样表型的富集达到16.5×±13.7gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD80gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba)，而其他亚群体的CD80双阴性含量较低gydF4y2Ba^−gydF4y2BaCD163gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba9×±6.4或CD163双阳性gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD80gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在1.1×±2.2时，非经典单核细胞也发生了类似的富集(图SgydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 b).这些发现表明，APS处理进一步丰富了供体中存在的M2极化，而处理本身并没有引起表型变化。APS在经典单核细胞和非经典单核细胞中富集CD163的量分别是白细胞中的17倍和12倍(图1)。gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 c).为了进一步表征单核细胞，我们评估了抗原呈递标记MHC-II的表达。mhc iigydF4y2Ba^+gydF4y2Ba单核细胞在APS和WBCs中分别占经典单核细胞的16%和14%，而非经典单核细胞在APS和WBCs中所占比例较大，分别为40%和35%(图1)。gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 d)。gydF4y2Ba

基因表达数据的GO分析、Nanostring注释、GSEA和PPI网络分析显示，在排序的单核细胞中，抗原呈递和处理途径上调gydF4y2Ba

进一步分析分类单核细胞(CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD3gydF4y2Ba^−gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD15gydF4y2Ba^−gydF4y2BaCD11bgydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD11cgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)，使用Rosalind平台进行的Nanostring的多重基因表达试验，从APS和wbc中筛选的单核细胞进行比较时，发现有109个差异调控基因;前50个差异调节基因如图所示。gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 e.为了探索预测的差异表达基因的功能关联，仅从具有物理相互作用的蛋白质(如物理复合体的一部分蛋白质)构建了一个STRING蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络，并使用Cytoscape 3.9.0可视化，这是一个用于复杂网络分析的开源平台，见图SgydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 c (gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．PPI网络由107个节点(差异表达基因)和268个边(节点间相互作用)高度连接。然后，我们使用知识发现工具来预测网络中的重要基因，以进一步了解由于APS处理导致的基因表达变化如何影响生物过程或途径。为了确定网络中的关键基因，使用CytoNCA 2.1量化中心性度量[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．基于子图中心性、中介中心性和亲和中心性三个最优中心性度量，得到网络中必需基因gydF4y2Ba菲英岛gydF4y2Ba，gydF4y2BaJak1gydF4y2Ba，gydF4y2BaJak3gydF4y2Ba，gydF4y2BaMapk1gydF4y2Ba，gydF4y2BaStat1gydF4y2Ba，gydF4y2BaStat3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba麦克米兰。gydF4y2Ba这些基因在图S中的PPI网络中以绿色表示gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 c。gydF4y2Ba

为了根据网络的连通性程度来识别PPI网络节点中高度互联的区域，我们使用了MCODE，分子复合物检测算法Cytoscape插件[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．模块分析确定了最重要的模块包含19个节点，gydF4y2BaJak1gydF4y2Ba，gydF4y2BaJak3gydF4y2Ba，gydF4y2BaStat3gydF4y2Ba，gydF4y2BaStat1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba菲英岛gydF4y2Ba，gydF4y2BaStat6gydF4y2Ba，gydF4y2BaStat5bgydF4y2Ba，gydF4y2BaIl4rgydF4y2Ba，gydF4y2BaIl6rgydF4y2Ba，gydF4y2BaIl6stgydF4y2Ba，gydF4y2BaHla-dragydF4y2Ba，gydF4y2BaHla-cgydF4y2Ba，gydF4y2BaHla-dpb1gydF4y2Ba，gydF4y2BaHla-ggydF4y2Ba，gydF4y2BaHla-bgydF4y2Ba，gydF4y2Ba抗原gydF4y2Ba，gydF4y2BaHla-egydF4y2Ba，gydF4y2BaTapbpgydF4y2Ba，gydF4y2BaTap1gydF4y2Ba，有69条边。该模块的子网用橙色表示，第一个邻居用蓝色表示，如图S所示gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 d.中心性测定所鉴定的必需基因均在显著模组内。值得注意的是，这19个基因中有12个位于差异表达前50位的基因中。gydF4y2Ba

为了进一步探索生物功能的潜在变化和关键途径，使用STRING进行基因本体(Gene Ontology, GO)分析。基因本体论(GO)对所有显著差异调节基因的分析发现，对于生物过程的类别，从APS中分类的单核细胞具有与以下组织修复相关的GO术语相关的功能富集:“il -4介导的信号通路和抗原处理”和“通过MHC类I通过ER通路提交内源性肽，tap无关”。分子功能类发现与抗原处理相关的术语富集，如TAP结合和TAP2结合。细胞成分类巨噬细胞迁移抑制因子受体复合物富集。使用蛋白质结构域(Pfam)数据库进行功能富集发现在以下结构域富集:MHC-I c端和STAT蛋白(蛋白质相互作用结构域、dna结合结构域和所有α结构域)。gydF4y2Ba

利用Rosalind平台(gydF4y2BapgydF4y2Ba_{邻接的gydF4y2Ba}< 0.05)。MySigDB通路收集发现与抗原处理和信号转导过程相关的几个显著丰富的术语(图1)。gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 f).发现以下MSigDB REACTOME术语的富集，I类MHC介导的抗原处理呈递(gydF4y2Ba哥伦比亚大学gydF4y2Ba，gydF4y2BaPsmb8gydF4y2Ba，gydF4y2BaTap1gydF4y2Ba)、抗原处理交叉呈递(gydF4y2BaPsmd7gydF4y2Ba，gydF4y2BaLy96gydF4y2Ba，gydF4y2BaHla-ggydF4y2Ba)、I类MHC抗原递呈折叠组装和肽负载(gydF4y2BaHla-ggydF4y2Ba，gydF4y2BaHla-cgydF4y2Ba，gydF4y2BaHla-egydF4y2Ba)和适应性免疫系统(gydF4y2Ba出售gydF4y2Ba，gydF4y2BaPsmd7gydF4y2Ba，gydF4y2BaLy96gydF4y2Ba)．Wiki通路显示蛋白体降解富集，IL-4信号通路(gydF4y2Ba”丛书gydF4y2Ba，gydF4y2BaStat3gydF4y2Ba，gydF4y2BaTyk2gydF4y2Ba)、IL-2信号通路(gydF4y2BaStat1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba菲英岛gydF4y2Ba，gydF4y2Ba麦克米兰gydF4y2Ba)和抑菌素M信号通路(gydF4y2BaPrkcdgydF4y2Ba，gydF4y2BaJak1gydF4y2Ba，gydF4y2BaJak3gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

然后，我们在Rosalind平台上使用Nanostring Annotations进行基因集富集分析，发现与细胞毒性相关的术语富集(gydF4y2Ba抗原gydF4y2Ba，gydF4y2BaHla-bgydF4y2Ba，gydF4y2BaHla-bgydF4y2Ba)、抗原处理(gydF4y2BaTap1gydF4y2Ba，gydF4y2BaTapbpgydF4y2Ba，gydF4y2BaPsmb9gydF4y2Ba，gydF4y2BaPsmb7gydF4y2Ba)，转运函数(gydF4y2Ba菲英岛gydF4y2Ba，gydF4y2BaItgamgydF4y2Ba，gydF4y2BaCd47gydF4y2Ba，gydF4y2BaCd44gydF4y2Ba)和细胞周期(gydF4y2Ba趋化因子受体Cxcr4gydF4y2Ba，gydF4y2BaTnfsf10gydF4y2Ba)．各基因集的整体差异表达(定向富集评分)显示，APS排序单核细胞的表达差异是血液的4倍(图1)。gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 g)。gydF4y2Ba

总的来说，通路分析在所有使用的数据库和集合中识别了抗原处理相关的基因集或术语。gydF4y2BaTap2gydF4y2Ba， TLR-4的拮抗剂肽，在单碘乙酸盐(MIA)诱导的OA大鼠模型中具有镇痛和抗炎作用，从而减少软骨损失[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．gydF4y2BaTap2gydF4y2Ba可以减少关节炎关节内的ROS从所采用的分析中确定的途径和术语表明与单核细胞的抗炎功能有关(gydF4y2BaIfi16gydF4y2Ba，gydF4y2BaStat3gydF4y2Ba，gydF4y2BaIl10ragydF4y2Ba，gydF4y2Ba趋化因子受体Cxcr4gydF4y2Ba，gydF4y2BaCd63gydF4y2Ba，gydF4y2BaCd47gydF4y2Ba)．gydF4y2BaStat3gydF4y2Ba，gydF4y2BaIl10ragydF4y2Ba,gydF4y2Ba趋化因子受体Cxcr4gydF4y2Ba在PPI网络最密集区域或第一邻区，表达变化超过4倍。gydF4y2Ba

APS处理后淋巴细胞富集并保持表型亚群gydF4y2Ba

我们用流式细胞术研究APS处理对淋巴细胞浓度的影响。CD3gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞比CD3细胞更普遍gydF4y2Ba^−gydF4y2BaCD19gydF4y2Ba^+gydF4y2BaB细胞。APS处理显著增加了白细胞中T细胞和B细胞的浓度，分别从1710,000±547,000 cells/mL和310,000±40000 cells/mL增加到1100万±3800,000 cells/mL和100万±384,000 cells/mL(图1)。gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 a)。CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞是主要的T细胞亚型，其次是CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba．CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaAPS处理后T细胞亚群分别从1,210,000±420,000增加到8,000,000±3,300,000 cells/mL, 343,000±143,000增加到2,430,000±1,380,000 cells/mL(图1)。gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 b)。gydF4y2Ba

然后我们用细胞内染色来研究T细胞的表型。经过APS处理后，CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaPMA/离子霉素刺激后，T细胞保持细胞因子表达的潜力，如图S所示，门控策略gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ．CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba干扰素γgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba,il - 4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba, IL-17AgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba与wbc相比，APS处理后显著富集。CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba干扰素γgydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞CD4含量从303,000±297,000增至142万±582,000 cells/mLgydF4y2Ba^+gydF4y2Bail - 4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞从24000±17000增加到99000±36000细胞/mL, CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaIL-17AgydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞19,000±15,000至74,000±18,000细胞/mL(图;gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 c)。CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba干扰素γgydF4y2Ba^+gydF4y2BaAPS处理后T细胞也显著富集，从184,000±115,000增加到990,000±340,000(图4)。gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 d).这些发现表明，黄芪多糖处理后白细胞的功能得以保持，黄芪多糖中第二丰富的免疫细胞亚群T细胞可能是生物活性因子的另一个来源。gydF4y2Ba

APS处理后RAG - KO - OA模型免疫细胞分数维持不变gydF4y2Ba

为了探索来自人类的APS的不同成分如何影响局部对损伤的反应，我们使用了10周雌性C57BL/6 RAG KO小鼠的创伤后骨关节炎模型。经韧带横断诱导单侧骨性关节炎2周后，实验组(gydF4y2BangydF4y2Ba= 5/组)注射3000分选CD45的全人APSgydF4y2Ba^+gydF4y2BaAPS细胞，3000个分类CD3gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba黄芪多糖的细胞，或黄芪多糖的脱细胞部分(只含有可溶性蛋白质)。盐水注射组和无手术组作为对照组。每个实验组注射20 μL确保了关节囊的完整性和关节附近APS的定位(研究设计见图。gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 a).注射两周后，对每个实验组的动物进行关节组织学检查(gydF4y2BangydF4y2Ba= 1/组)和腹股沟淋巴结qRT-PCR (gydF4y2BangydF4y2Ba= 5/组)和其余的关节(gydF4y2BangydF4y2Ba= 4 /组)。与没有手术的对照组相比，任何治疗组的负重测量都没有恢复。APS组的反应时间明显更长，这表明该组可能比盐水组和无细胞组的APS组经历更多的疼痛(图1)。gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 b).代表性的藏红花- o染色(gydF4y2BangydF4y2Ba= 1/组)如图所示。gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 C观察关节内蛋白多糖含量。gydF4y2Ba

然后研究注射后APS细胞组分的存活情况。免疫荧光染色证实了单次注射后2周APS细胞组分的持久性。APS治疗组滑膜中存在人阳性CD4细胞(APS, CD3gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba从APS和CD45中排序gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba显示了细胞的持久性和细胞部分的持久性，这可能对APS治疗结果很重要(图1)。gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 d).组织内免疫细胞可以长寿命。淋巴细胞可以像记忆T细胞一样存活数周甚至数年。注射的免疫细胞存活时间超过血小板的寿命，对微环境的贡献远远超过最初注射和APS中蛋白质的生物活性。gydF4y2Ba

为了研究治疗的潜在全身效应，评估了从受伤关节排出淋巴的腹股沟淋巴结中促炎和抗炎细胞因子的基因表达。gydF4y2BaIl1bgydF4y2Ba，gydF4y2BaIl10gydF4y2Ba，gydF4y2BaIfnggydF4y2Ba,gydF4y2BaIl4gydF4y2Ba实验组间引流腹股沟淋巴结无明显变化，提示注射没有使全身反应极化(图SgydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 a). IL-17细胞因子在临床前和临床研究中证实了骨关节炎的病理生理作用[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．量化的gydF4y2BaIl17fgydF4y2Ba与其他组相比，盐水组和无细胞APS组小鼠腹股沟引流淋巴结的mRNA水平升高，但未达到统计学意义(图SgydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 一个)。gydF4y2BaIl17agydF4y2Ba所有组均未在关节或淋巴结内检测到。gydF4y2Ba

为了研究治疗的局部效应，我们对全关节相关基因的基因表达进行了研究。一种广谱MMP抑制剂，对减少软骨退化很重要，gydF4y2BaTimp1gydF4y2Ba与没有手术的对照组相比，所有治疗组的关节表达均显著增加。调节细胞因子,gydF4y2BaTgfb1gydF4y2Ba，均显著增加关节内APS、无细胞APS和CD3的表达gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba从APS治疗组和未手术对照组的细胞中分离出来。gydF4y2BaTgfb2gydF4y2Ba各治疗组间表达无显著差异。gydF4y2BaIl17bgydF4y2Ba治疗组间关节表达无明显变化gydF4y2Ba．gydF4y2Ba此外，促炎细胞因子在关节的表达，gydF4y2BaTnfagydF4y2Ba,金属蛋白酶gydF4y2BaMmp12gydF4y2Ba,gydF4y2BaDdr1gydF4y2Ba在软骨形成过程中控制MMP-13的表达，组间无显著差异(图SgydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 b)gydF4y2Ba．gydF4y2Ba促炎细胞因子gydF4y2BaIl1bgydF4y2BaCD3表达明显增加gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba当与所有组比较时，从APS组中排序。gydF4y2Ba

黄芪多糖的细胞组分是抗炎IL-1Ra细胞因子的主要来源，黄芪多糖加工后细胞组分富集gydF4y2Ba

APS可从广泛的OA患者中制备，且抗炎细胞因子持续优先富集[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．伤口愈合级联中细胞因子的多效性和动力学需要进一步了解骨关节炎的病理和治疗。为了评估伤口愈合级联中显著的细胞因子和生长因子的浓度，我们对APS和血液的细胞间隔物(裂解物)和可溶性部分(血浆)进行了Luminex细胞因子测定。所有的白细胞系都会产生细胞因子。一旦被激活，血小板就会释放储存的细胞因子和趋化因子。我们没有区分Luminex结果的细胞类型。根据文献，我们可以假设哪些细胞类型可能有助于相关生物活性因子的来源。APS中IL-1Ra蛋白含量最高(103000±50000 pg/mL)，其次是IGF-1(93000±17000 pg/mL)和TGF-β1(15000±8000 pg/mL)。IGF-1是一种生长激素，主要由肝脏产生，然后释放到循环中[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．TGF-β1是一种由所有白细胞产生的多效细胞因子[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．IL-1β和TNF-α是促进OA病理生理的促炎细胞因子，主要由巨噬细胞产生[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．活化的血小板也可释放IL-1β和TNF-α [gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．TNF-α也由其他免疫细胞分泌，如单核细胞、T细胞、NK细胞和NKT细胞[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．在APS中IL-1β和TNF-α水平较低，分别为57±5 pg/mL和40±27 pg/mL(图SgydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 a).其他研究已注意到APS中IL-1β浓度极低[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．另一项描述APS细胞因子谱的研究没有检测到TNF-α [gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．非细胞可溶性蛋白部分显著增加了其他合成代谢细胞因子，如TGF-β1和IGF-1，分别增加了5×和2×(图SgydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 b) IL-1Ra和IL-1β之间的平衡在炎症稳态中起关键作用。注意细胞因子的浓度是很重要的。虽然APS中存在IL-1β和TNF-α等促炎细胞因子，但抗炎细胞因子的浓度要高出4-5个数量级。gydF4y2Ba

在APS中富集的抗炎细胞因子中，检测显示细胞部分(裂解物)特异性的IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)显著增加，变化为17倍。IL-1Ra的显著增加与其他描述APS细胞因子富集的研究相似[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．血浆部分未检出IL-1Ra。这是值得注意的，因为之前的研究发现，与全血相比，APS的IL-1Ra增加5.9倍，白细胞增加5倍[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．首次单次注射黄芪多糖的人体临床试验结果发现，黄芪多糖中白细胞浓度和IL-1Ra:IL1-β比值高于1000的受试者对黄芪多糖治疗的反应比整个研究人群更大[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．APS中WBC浓度与IL-1Ra显著相关，正如预测的那样，IL-1Ra的常见亚型通常存在于细胞内部[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．IL-1Ra的细胞内亚型主要由中性粒细胞和单核细胞产生[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．中性粒细胞是黄芪多糖最终产物中的主要免疫细胞类型，可能是细胞内有效抗炎IL-1Ra的主要来源。本研究中健康志愿者IL-1Ra: il -1 β比值较高，提示他们对黄芪多糖注射有反应。Luminex细胞因子试验证实APS的细胞部分是IL-1Ra的主要来源，如先前的研究所示[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．在所研究的分析物中，IL-1Ra是在细胞部分中检测到的唯一分析物。黄芪多糖细胞组分中未检测到IGF-1、IL-1β、TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。APS和血液中均未检测到TGF-β3。在一个APS细胞组分样品中检测到少量的TNF-α (4.7 pg/mL)。值得注意的是，TGF-β2(386±38 pg/mL)在血浆组分中被检测到，而在APS的血浆或细胞组分中未被检测到(图SgydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 一个)。gydF4y2Ba

本研究的主要发现是黄芪多糖处理改变了血液中发现的免疫细胞组成，黄芪多糖处理诱导了依赖于细胞类型的显著差异基因表达，这可能对OA治疗结果很重要。在这里，我们通过定义免疫细胞类型组成和表型来分析APS(一种用于管理和治疗膝骨关节炎的正畸生物疗法)中的免疫人群。gydF4y2Ba

血液衍生物是不同程度的生物活性因子和细胞的复杂混合物，其在治疗肌肉骨骼疾病中的作用模式尚不完全清楚。临床研究表明，自体移植具有免疫细胞的正骨生物制剂到关节炎关节可能显著有助于APS的治疗效果[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ，gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ，gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．在APS的首次人体临床试验中，高浓度WBC和IL-1Ra与应答者和改善治疗结果相关。这些结果表明黄芪多糖的细胞成分在其治疗效果中起着重要作用。然而，由于rct有限，PRP治疗中的白细胞包涵性尚未建立。在使用含有prp的白细胞的临床研究中，大多数表明了白细胞是否存在，但没有调查由于处理引起的细胞组成变化或确定存在的免疫亚型。在这项研究中，我们定量评估了APS处理后免疫细胞群与白细胞的变化。我们发现了CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞是活的，高度集中在APS中，其中中性粒细胞和T细胞是最丰富的免疫细胞类型。gydF4y2Ba

免疫细胞表型和激活状态对OA疾病的状态和进展至关重要。已知的细胞表型具有特定的功能，并产生细胞因子和趋化因子影响微环境。巨噬细胞在正常关节生理和OA进展中发挥重要作用。分解代谢微环境中固有的内源性DAMPs有助于炎症小体激活和巨噬细胞极化。单核细胞来源的浸润性巨噬细胞已被证明可促进软骨炎症和退变[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．在本研究中，我们探索了APS处理后的单核细胞表型。流式细胞术分析发现APS和wbc中的优势单核细胞群为经典单核细胞。CD163gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba表达比CD80更显性gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在经典单核细胞和非经典单核细胞中都有CD163gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba经典单核细胞是APS中最丰富的单核细胞亚型。APS处理富集抗炎CD163gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba这在wbc中已经存在。我们还利用纳米串基因表达试验探索了APS处理后排序单核细胞的生物功能和关键通路的潜在变化。从黄芪多糖中筛选出的单核细胞与从白细胞中筛选出的单核细胞相比，在抗原处理和抗炎功能相关的基因表达上存在显著差异。由差异表达基因构建的PPI网络的模块分析和中心性测量突出了许多基因的富集项和基因集，如gydF4y2BaTap1gydF4y2Ba，gydF4y2BaTapbpgydF4y2Ba，gydF4y2BaHla-ggydF4y2Ba,gydF4y2BaStat3gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

PRP疗法可以包含不同浓度的促炎和抗炎生长因子。不同配方的PRP可对临床结果产生抑制作用。APS处理方法的结果是一个强大的混合抗炎细胞因子和低水平的促炎因子浓缩生长因子拮抗剂。先前的研究已经认识到供体在黄芪多糖组成上的差异性，其影响已在体外进行了研究。独立于供体变异，APS持续减少人THP-1单核细胞中IL-1β驱动的IL-8和TNF-α的产生[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．在本研究评估的生物分子中，抗炎细胞因子如IL-1Ra和IGF-1的浓度高于促炎细胞因子如IL-1β和TNF-α。与血液相比，TGF-β1在APS中增加了5倍。我们没有调查以细胞类型测定的生物分子来源。这些发现与之前的研究一致，即APS具有高浓度的合成代谢生长因子，如血小板衍生生长因子(PDGF)和胰岛素样生长因子-1 (IGF-1) [gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．TGF-β1等生长因子在创面愈合的初始阶段很重要。单核细胞来源的巨噬细胞是生长因子如PDGF, TGFβ-1和FGF的来源。体外研究发现，TGF-β1尤其通过巨噬细胞-成纤维细胞串扰促进胶原合成和沉积[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．TGF-β1通常被认为具有抗炎作用，促进替代巨噬细胞激活[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．在RAG KO研究中，gydF4y2BaTgfb1gydF4y2Ba在APS处理后关节内明显增加。白细胞介素是体内IL-1Ra等促炎细胞因子拮抗剂的主要来源。值得注意的是，在本研究中IL-1Ra只在APS的细胞部分中发现。IL-1Ra是一种重要的炎症抑制因子，它与IL-R1竞争性结合，从而抑制IL-1α和IL-1β到IL-1RI，从而减少软骨和骨破坏。IL-1Ra具有天然的生物学功能，如减弱il -1诱导的基因表达，抑制il -1诱导的IL-6和IL-8的产生[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ，gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．在RAG KO研究中，MMP抑制剂，gydF4y2BaTimp1gydF4y2Ba与未手术对照组相比，APS治疗后关节表达明显增加。这与体外APS研究一致，APS研究发现抑制破坏性蛋白酶，如IL-1β和TNF-α刺激软骨细胞的MMP-13的减少[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．gydF4y2Ba

在活体研究中，免疫荧光染色证实APS注射后人类细胞的持久性和存活。这些结果表明，APS的细胞成分可能比单独的可溶性蛋白部分提供更持久的治疗，这是由于某些组织驻留白细胞亚型(如T细胞)的长寿命特性。APS处理后，T细胞是第二丰富的免疫细胞亚型。CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞比CD8更丰富gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba经过APS处理的T细胞和两种亚型均保持产生细胞因子的倾向。免疫细胞可延长生物活性因子的释放时间。这是一个重要的考虑，因为人们认为血小板在激活后的一个小时内就会耗尽α -颗粒中的生物活性因子[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．此外，如Mariani等人所证实的，白细胞细胞组分可以影响脱粒程度，从而影响存在的生物活性因子的浓度[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．在PRP加工中使用的常见密度梯度离心技术后，更年轻、更致密的血小板通常在淡黄色的外膜或WBC部分[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．这表明，与无白细胞的PRP相比，含有白细胞的PRP也含有更多的血小板和更致密的α颗粒。在一项研究中，无论离心速度如何，富白细胞PRP中的血小板浓度都高于纯PRP [gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．PRP中的非血小板细胞是正常血小板功能所必需的，如凝血酶生成、生长因子释放和血块收缩[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．多中心双盲随机盐对照试验的3年随访研究了单次关节内注射APS的效果，发现对于轻中度膝关节骨性关节炎患者，APS是安全的，患者的疼痛得到显著改善[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．比较PRP与替代注射的rct meta分析发现，PRP在6个月和12个月的时间点达到了临床意义，提示PRP的持久性[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．这些初步发现强调了矫正生物制剂的潜在持久性，未来的研究应确定治疗的持久性方面，特别是探索细胞成分的持久性。gydF4y2Ba

经典激活的M1巨噬细胞表型通过产生调节滑膜成纤维细胞、软骨细胞和其他免疫细胞的促炎介质促进OA进展。一项研究评估了人类骨性关节炎组织中的免疫细胞浸润组成和正常对照受试者的微阵列数据，以基于基因表达谱识别诊断标志物，发现骨性关节炎组织中M1巨噬细胞浸润增加，肥大细胞和中性粒细胞浸润减少[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．在另一项研究中，与健康对照组相比，在OA患者的外周血和滑膜液中发现了更高的M1/M2巨噬细胞比率。M1/M2巨噬细胞比值与骨关节炎的Kellgren-Lawrence分级显著相关[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．抑制巨噬细胞介导的炎症已被认为是OA的一种治疗策略[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．在临床前研究中，靶向巨噬细胞导致了OA的不同结果。一项对带有增强的M1或M2巨噬细胞的转基因小鼠的研究发现，M1巨噬细胞使疾病进展，M2则使疾病衰减[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．另一项研究发现，在肥胖的fas诱导的凋亡转基因小鼠中，消耗M1和M2巨噬细胞并不能减少OA的进展[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．有一种巨噬细胞表型涉及OA，其中一种的缺失或另一种的增强可能与治疗无关。这些数据表明，需要一种多功能治疗，而仅靶向巨噬细胞的治疗是不够的。黄芪多糖是一种复杂的抗炎细胞因子、生长因子和免疫细胞的混合物，其成分作用于OA病理生理的各个方面。gydF4y2Ba

认识到本研究的局限性。我们用健康志愿者代替OA患者来评估APS处理的影响。先前的研究表明，无论OA状态或年龄如何，所有患者的APS处理都会产生合成代谢和抗炎产物[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．wbc作为对照，比较APS处理而不是全血。白细胞分离不是全血的精确代表，但白细胞作为适当的对照，因为我们想评估免疫细胞组成。用于分离白细胞的密度梯度从全血中捕获了大部分免疫细胞。此外，在计算细胞浓度时使用原始全血样本容量。PRP含有数百个生物活性分子，这里只评估了其中的少数。PRP疗法的独特之处在于该疗法具有广泛的适用性，但不同的病理可能需要富集某些细胞类型/亚型和生物活性因子的特定配方。因此，研究更多针对不同应用的生物活性因子是至关重要的。Mariani等人评估了PRP表征研究中通常不评估的PRP生物分子，如RANTES/CCL-5、MCP-3/CCL-7和tf -4/CXCL-4，发现不同PRP制备方法之间的浓度差异[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．该研究的另一个局限性是用于纳米串基因表达分析的样本量小(gydF4y2BangydF4y2Ba= 4).样本量小限制了研究的统计能力，也无法探索与基因表达相关的潜在供体变异。然而，我们能够在APS处理后的单核细胞中发现基因表达的极化变化，许多与类似生物过程相关的基因显示抗原处理相关基因和抗炎功能上调，这可能有助于治疗。我们没有确定处理技术的哪些方面导致免疫细胞中的优先富集和基因表达变化。未来的研究将对APS加工过程中特定部分引起的免疫细胞变化提供进一步的理解，以优化下一代矫正生物制剂。我们无法评估APS在免疫缺陷RAG KO小鼠模型中的免疫效果。我们证明了APS的免疫细胞部分的持久性，这表明细胞部分可能在最初注射后的治疗中发挥作用，免疫细胞可能在一定程度上解释了临床所见的持久性。我们没有在OA小鼠模型中研究注射后APS细胞的维持及其表型。尽管在临床前模型和临床人群之间可能存在差异，但还需要进一步研究注射后免疫细胞表型，以确定APS细胞组分如何直接促进APS治疗的临床效用。此外，注射细胞与微环境相互影响。注射在APS中的免疫细胞可以通过产生特定的旁分泌因子和细胞因子来调节局部环境，反之，局部环境中的细胞和细胞外基质又可以影响APS细胞。 Multiple studies demonstrate that the circulating bioactive factors and cells in the blood are harnessed for regenerative processes when an acute injury occurs. Blood-derived orthobiologics are thought to promote similar regenerative processes when locally injected into arthritic joints, although the mechanism of action is not fully understood. RAG KO mice do not produce mature T and B cells. Although this feature of RAG KO mice is important to allow us to inject human cells into the mice without immunogenic reactions, it does not allow us to make any meaningful conclusions about the therapeutic effects of APS in this model. It also does not allow us to meaningfully examine APS phenotype changes considering the full context of the pathophysiology of OA that includes the adaptive immune system. Future studies would require immune competent and autologous APS to draw conclusions about which immune cell types are important for functional healing, how the APS cell phenotype may change once injected into an arthritic joint and the contribution of these cells to the therapeutic effects of APS. Nonetheless, we were able to explore the survival of APS cells after injection in the in vivo model.

阐明PRP的治疗活性成分，对于优化治疗成分的持久性和潜在选择性富集的加工技术的未来发展具有重要意义。众所周知，由于年龄和性别等各种因素，免疫反应存在差异。需要进一步研究年龄、性别和患者异质性如何广泛影响免疫细胞和PRP处理后的作用机制。进一步了解PRP的治疗活性成分，如长寿白细胞，也将有助于在治疗前根据患者的PRP成分预测其是否会对治疗产生反应，从而更好地为治疗方法提供信息。本研究未探讨的PRP生物活性成分，如细胞外囊泡，由于血小板脱落而存在于PRP中，具有免疫调节作用，支持低级别凝血酶生成[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．先前的研究表明，血小板中的凋亡微粒在极化单核细胞向M2促进愈合的巨噬细胞(CD14gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCCR5gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba趋化因子受体CXCR4gydF4y2Ba^++gydF4y2Ba)[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．需要进一步研究PRP的其他成分如细胞外囊泡的作用。APS的进一步表征对于获得治疗的具体作用模式的临床见解至关重要，特别是对于理解是什么促成了治疗的持久性。确定最佳的成分、注射量、注射次数和/或频率将有助于建立矫正生物制剂在膝关节骨性关节炎治疗中的应用标准指南。gydF4y2Ba

在病变部位局部注射PRP可介导促炎过程，减少与膝骨关节炎相关的分解代谢环境，以恢复内稳态并促进修复。尽管PRP有广泛的用途，但在其细胞和可溶性蛋白组分方面，其组成的标准化有限。目前只有有限的rct来阐明PRP中每个成分的治疗作用。由于加工技术的不同和缺乏标准化，PRP的组成不同，导致对治疗相关成分的知识有限。了解加工对细胞表型和生物活性因子的原生物成分和浓度的影响对于提高治疗的可重复性和预测能力非常重要。尽管血小板被认为是主要的治疗因素，但PRP的作用机制还没有完全了解，免疫细胞部分的作用也没有被完全询问。我们的研究结果表明，APS处理改变了免疫细胞的组成和表型。注射后APS细胞组分的持久性表明，细胞组分可以解释临床所见APS的治疗持久性。未来的工作需要定义治疗相关的PRP成分，并在rct中进一步广泛评估PRP治疗方法，以实现下一代矫正生物制剂和有意义的一致临床结果。gydF4y2Ba

APS的处理gydF4y2Ba

血液样本来自4名献血者(100-120 mL)。将血液样本收集在肝素化管中，并分离用于WBC收集、APS处理，并分配1 mL全血用于Luminex试验对照。所有捐献者的样本都是在同一天准备的。简单地说，为了进行APS处理，将血液(40-55 mL)抽到60 mL注射器中，加入5 mL抗凝剂柠檬酸葡萄糖溶液配方a (ACD-A)，并使用一次性nSTRIDE®APS试剂盒(Biomet Biologics, Warsaw, IN)处理，以获得APS。处理的第一部分使用nSTRIDE®细胞分离器分离细胞和血小板成分。过程的第二部分使用nSTRIDE®浓缩器浓缩细胞溶液，使用聚丙烯酰胺吸收珠生产APS [gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．gydF4y2Ba

WBC处理、流式细胞术和FACS荧光激活的APS细胞分选gydF4y2Ba

所有样品在HANK的平衡盐溶液HBSS中提取至40 mL，并根据制造商的协议使用Ficoll-Paque PLUS溶液(瑞典乌普萨拉Pharmacia LKB)密度梯度离心或使用氯化铵-钾裂解缓冲液(生物质量)进行红细胞裂解制备。对于细胞内染色，用细胞刺激鸡尾酒和蛋白质转运抑制剂(eBioscience)刺激细胞。随后对细胞进行清洗和表面标记染色。然后，用Cytofix/ cytooperm (BD)对细胞进行固定和渗透，然后用细胞内标记物染色。流式细胞术实验使用Attune NxT流式细胞仪(Thermo Fisher Scientific)进行。使用FACSDiva (BD Biosciences)或FACSAria II (BD Biosciences)进行FACS。使用附加文件中列出的抗体面板对细胞进行染色gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 S1:表。在每次实验中，所有供体样本都在同一天进行记录。根据使用的全血样本的原始体积，人工量化总细胞浓度。通过将活细胞的频率乘以该亚群的活细胞频率和整个样本的人工量化细胞浓度，从流式细胞术得到的活细胞频率被用来估计每个所需细胞亚型的细胞浓度。gydF4y2Ba

纳米串基因表达分析gydF4y2Ba

免疫细胞组分使用来自APS和血液(粒细胞、T细胞和单核细胞)的FACS进行分类，并用于分离RNA用于纳米串基因表达谱分析。样品在测定前存放在−80℃的750 μL TRIzol LS试剂(Invitrogen)中。根据制造商的协议，使用RNeasy Plus Micro kit (Qiagen)进行RNA分离。根据制造商的协议，将样品与报告编码集杂交。基因表达谱使用Nanostring nCounter分析系统，使用Nanostring panccancer免疫分析编码集(770个基因)获得。数据采用ROSALIND®(gydF4y2Bahttps://rosalind.onramp.bio/gydF4y2Ba)，使用由ROSALIND公司(San Diego, CA)开发的HyperScale架构。读取分布百分比、小提琴图、标识热图和样本MDS图是作为QC步骤的一部分生成的。标准化，折叠变化，以及gydF4y2BapgydF4y2Ba-值使用Nanostring提供的标准计算。ROSALIND®遵循nCounter®高级分析协议，通过来自同一车道的归一器探针的几何平均值来划分lane内的计数。基于NormqPCR R库1中实现的geNorm算法选择用于归一化的管家探针。在ROSALIND上使用Nanostring细胞类型分析模块计算各种细胞群的丰度。ROSALIND对单元格类型剖析结果进行过滤，以包括得分为a的结果gydF4y2BapgydF4y2Ba-value大于或等于0.05。褶皱的变化和gydF4y2BapgydF4y2Ba-值使用nCounter®高级分析2.0用户手册中描述的快速方法计算。gydF4y2BapgydF4y2Ba-值调整使用估算错误发现率(FDR)的Benjamini-Hochberg方法。对差异表达基因的最终热图进行基因聚类，使用的是fpc R库2的围绕中间体(PAM)划分方法，该方法考虑了通路上所有信号的方向和类型，每个基因的位置、作用和类型等。利用超几何分布分析路径的富集、基因本体、领域结构等本体。利用topGO R库3确定GO术语之间的局部相似度和依赖性，进行Elim剪枝校正。富集分析参考了几个数据库来源，包括Interpro4、NCBI5、MSigDB6、7、REACTOME8和WikiPathways9。富集是相对于一组与实验相关的背景基因进行计算的[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba，gydF4y2Ba52gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba，gydF4y2Ba54gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba，gydF4y2Ba56gydF4y2Ba，gydF4y2Ba57gydF4y2Ba，gydF4y2Ba58gydF4y2Ba，gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．统计显著性极限gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05，倍数变化阈值设置为±1.5。样本相关热图是使用ComplexHeatMap R包创建的[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．差异表达基因的PPI网络是使用STRING数据库(版本11.5，gydF4y2Bahttps://string-db.org/gydF4y2Ba)[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．使用STRING数据库进行STRING PPI网络分析。使用Cytoscape 3.9.0可视化STRING PPI网络[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．Cytoscape插件CytoNCA 2.1用于量化中心性度量[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．使用Cytoscape插件的默认设置、MCODE、分子复合物检测算法来识别PPI网络中高度互连的区域[gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ］．gydF4y2Ba

Luminex化验gydF4y2Ba

每位献血者取两毫升黄芪多糖及一毫升全血对照(gydF4y2BangydF4y2Ba= 4)经1000离心分离成血浆(可溶性部分)和细胞组分(裂解物)gydF4y2BaggydF4y2Ba收集血浆和细胞裂解物，在测定前存放在- 80°C。Luminex检测是由约翰霍普金斯大学的人类免疫核心使用Luminex xMAP技术进行的。这些检测是按照HIC SOP-25“Millipore细胞因子检测”进行的，并进行了修改，以匹配相应Milliplex磁珠板趋化因子/细胞因子的特定厂商指南。样品在三口重复井中进行了下入。IGF-1样品按1:60稀释，TGFβ1、2、3样品按1:30稀释。对于IL-1β、TNF-α和IL-1Ra，样品未被稀释。为每种分析物生成标准曲线，以确定每种样品的浓度。在报告的最终浓度计算中考虑了APS处理和测定稀释的样品。gydF4y2Ba

外科手术gydF4y2Ba

创伤后骨关节炎小鼠模型为10周雌性C57BL/6 RAG KO (The Jackson Lab)小鼠(gydF4y2BangydF4y2Ba= 5/组)采用单侧前交叉韧带横断法。OA发病2周后，各治疗组分别关节内注射生理盐水、人用APS、无细胞成分APS、APS中CD3+分选细胞、APS中CD45+分选细胞20 μL。APS处理了3个捐献者并汇集在一起。注射两周后采集动物，对引流淋巴结和关节进行qRT-PCR检测，并对关节进行组织学分析。gydF4y2Ba

实时定量PCR检测gydF4y2Ba

根据制造商的协议，使用TRIzol (Invitrogen)从损伤同侧的整个淋巴结或切除过多肌肉/脂肪组织的负重关节中提取总RNA。RNA纯化使用RNeasy Plus Mini试剂盒(Qiagen)。简单地说，为了进行mRNA检测，2.5 μg的mRNA使用上标IV VILO Master Mix (Invitrogen)合成为cDNA。定量实时qRT-PCR采用Taqman引物(Thermo Fisher Scientific)和StepOnePlus real- PCR系统(Life Technologies)， PCR反应量为100 ng/well cDNA，总反应量为20 μL。利用Livak方法(ΔΔCt)计算相对基因表达量。采用内参基因RER-1计算ΔCt，实验组归一化至无手术对照组。gydF4y2Ba

用TaqMan引物检测关节和腹股沟淋巴结。id如下:gydF4y2BaRer1gydF4y2Ba: Mm00471276,gydF4y2BaIfng: Mm01168134_m1gydF4y2Ba，gydF4y2BaIl1bgydF4y2Ba: Mm00434228,gydF4y2BaIl4gydF4y2Ba: Mm00445259,gydF4y2BaIl10gydF4y2Ba: Mm01288386,gydF4y2Ba使用Il13gydF4y2Ba: Mm00434204,gydF4y2BaIl17f: Mm00521423_m1gydF4y2Ba，gydF4y2BaIl17ra:gydF4y2BaMm00434214_m1,gydF4y2BaIl17b: Mm01258783_m1gydF4y2Ba，gydF4y2BaTimp1: Mm01341361_m1gydF4y2Ba，gydF4y2BaTgfb1: Mm01178820_m1gydF4y2Ba，gydF4y2BaTgfb2: Mm00436955_m1gydF4y2Ba，gydF4y2BaTnfa: Mm00443258_m1gydF4y2Ba，gydF4y2BaMmp12: Mm00500554_m1gydF4y2Ba，gydF4y2BaDdr1: Mm01273496_m1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

组织学评价gydF4y2Ba

治疗两周后，处死动物，小鼠整个关节固定在4%多聚甲醛(PFA)中，在10% EDTA中脱钙约2周。脱钙后，样品脱水并包埋在石蜡中。整个关节以7 μm的厚度进行切片，并根据制造商的协议使用Safranin-O和Fast Green染色(应用生物科学)进行蛋白多糖染色。样品在Axio Observer上以× 20倍放大倍率成像。Z1(蔡司)显微镜与Axiocam 305彩色成像装置。在成像前进行Köhler对齐。在亮场对比法中，每个关节周围拍摄2 × 2的平铺图像。然后在Adobe Photoshop CS5 Extended Version 12.0 × 64中旋转和裁剪图像，以对齐所有关节。gydF4y2Ba

免疫荧光染色gydF4y2Ba

用免疫荧光法评价人CD4的表达。采用标准方法对FFPE关节7 μm切片进行脱蜡和再固定。热介导抗原提取在pH值为6的柠檬酸缓冲液(PerkinElmer, AR600250ML)中进行，在95°C下进行15分钟。用3% H阻断内源性过氧化物酶gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba切片用10% BSA在TBS-T (Sigma, Thermo Scientific)缓冲液阻塞30分钟，然后与CD4一级抗体(1:50 00,ab133616, Abcam)或IgG同型对照在相同浓度(ab172730, Abcam)的10% BSA在TBS-T中孵育一夜。根据制造商的协议，使用MACH 3兔HRP聚合物检测系统检测CD4兔抗体(BIOCARE MEDICAL, M3R531H)。根据制造商的协议，使用Opal 650 (PerkinElmer)进行酪氨酸胺信号放大(TSA)可视化。切片用水和TBS-T冲洗，DAPI反染色5分钟，使用DAKO安装介质(Agilent)安装，盖滑，随后成像。同型对照和初级删除作为对照，使用识别的人类外科手术丢弃的乳腺胶囊样本，如图S所示gydF4y2Ba世界杯欧洲区预选赛赛程积分 ．样品在Axio Observer上以× 20倍放大倍率成像。Z1(蔡司)显微镜与Axiocam 506单波成像装置。图像是通过在Zen Blue软件版本Zen 2.5 Pro中应用最大强度投影(MIP)创建的。gydF4y2Ba

后肢负重评估gydF4y2Ba

测量未手术对照组小鼠的负重，并与ACLT组的生理盐水对照组或APS、CD3组进行比较gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba、CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba，或不使用不电容测试仪(哥伦布仪器)进行细胞处理的APS。ACLT肢体上的重量分布百分比被用作OA患者关节刺激的标记。在不电容测试仪上方的一个有角度的盒子里，小鼠被放置后爪站立。在这种姿势中，每个后爪都放在一个独立的力板上，力(gydF4y2BaggydF4y2Ba)对每个肢体的应用进行了量化。记录连续三个3秒的读数并取平均值，得到平均分。gydF4y2Ba

后肢响应能力gydF4y2Ba

小鼠被放置在55°C的透明笼状热板上。以跳跃或舔爪表示的后肢反应潜伏期记录为反应时间。在牺牲所有动物组的小鼠之前，测量后肢反应。每只老鼠取三次反应，取平均值得到个体的平均反应时间。gydF4y2Ba

统计数据gydF4y2Ba

使用多个未配对进行统计分析gydF4y2BatgydF4y2Ba-免疫细胞剖面数据和巨噬细胞极化数据的多次比较没有校正的统计显著性检验。对于淋巴细胞数据，多重未配对gydF4y2BatgydF4y2Ba-试验采用Holm-Sidak法进行多次比较。对CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞内的数据,未配对gydF4y2BatgydF4y2Ba以及与双尾gydF4y2BapgydF4y2Ba价值是就业。体内研究数据采用普通单因素方差分析和Tukey多重比较检验。未配对gydF4y2BatgydF4y2Ba以及与双尾gydF4y2BapgydF4y2Ba-value用于Luminex数据。对于所有统计检验，alpha = 0.05。gydF4y2Ba

研究批准gydF4y2Ba

所有的程序都经过约翰霍普金斯大学动物护理和使用委员会的批准，并按照约翰霍普金斯大学的规程指南进行。全血样本来自4名人类志愿者，并获得WCG IRB委员会(1019 39th Avenue SE Suite 120, Puyallup, WA 98374-2115)的有效同意(WIRB HBD-001研究#:1115097)。受试者被鉴定。乳房胶囊样本作为免疫荧光染色的对照样本，是从接受乳房植入物交换或置换手术的患者中识别出的外科丢弃物。gydF4y2Ba

本稿件中所有相关数据均包含在已发表的稿件或补充材料中。gydF4y2Ba

该研究由Zimmer Biomet和Morton Goldberg椅资助。我们感谢与M.T. Wolf有益的免疫荧光染色讨论。A.N.P.和D.R.M.在研究期间获得了NSF-GRFP奖#DGE-1746891的支持。一些原理图是用gydF4y2BaBiorender.comgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. Alexis N. Peña和Sven D. Sommerfeld对这项工作做出了同样的贡献。gydF4y2Ba

作者和联系gydF4y2Ba

1. 翻译组织工程中心，约翰霍普金斯大学，400 n百老汇史密斯大厦5楼，马里兰州巴尔的摩，21231gydF4y2Ba

   Alexis N. Peña, Sven D. Sommerfeld, Amy E. Anderson, Jin Han, David R. Maestas Jr, Joscelyn C. Mejias和Jennifer H. ElisseeffgydF4y2Ba

2. 美国巴尔的摩约翰霍普金斯大学生物医学工程系gydF4y2Ba

   Alexis N. Peña, David R. Maestas Jr & Jennifer H. ElisseeffgydF4y2Ba

3. 威尔默眼科研究所，约翰霍普金斯大学，巴尔的摩，马里兰州，美国gydF4y2Ba

   Alexis N. Peña, Sven D. Sommerfeld, Jin Han, David R. Maestas Jr, Joscelyn C. Mejias和Jennifer H. ElisseeffgydF4y2Ba

4. 美国巴尔的摩约翰霍普金斯医学院细胞与分子医学系gydF4y2Ba

   艾米·e·安德森gydF4y2Ba

5. Zimmer Biomet, 56 East Bell Drive, Warsaw, IN, 46581, USAgydF4y2Ba

   詹妮弗·伍德尔-梅和威廉·金gydF4y2Ba

6. 彭博~吉米癌症免疫治疗研究所和西德尼·吉米综合癌症中心，约翰霍普金斯大学医学院，巴尔的摩，马里兰州，美国gydF4y2Ba

   Sudipto GangulygydF4y2Ba

7. 美国巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院肿瘤系和Sidney Kimmel综合癌症中心gydF4y2Ba

   Sudipto GangulygydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

J.H.E、J.W.M、W.K、A.N.P、S.D.S、a.a.和J.H.设计了研究研究。A.N.P, S.D.S, a.a.， j.h.和D.R.M.进行了实验，获取了数据，并对数据进行了分析。J.C.M.和S.G.对数据分析做出了贡献。J.W.M.和W.K.为APS加工提供了设备和试剂。所有作者都对稿件的撰写做出了贡献。作者们阅读并批准了最终稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba詹妮弗·h·ElisseeffgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

J.H.E.持有Unity Biotechnology和Aegeria Soft Tissue的股权，是Tessera Therapeutics、HapInScience和Font Bio的顾问。Jennifer Woodell-May和William King在研究期间是Zimmer Biomet公司的有偿员工。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

卡塔尔世界杯常规比赛时间施普林格自然对出版的地图和机构附属的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循创作共用署名4.0国际许可协议(Creative Commons Attribution 4.0 International License)，该协议允许在任何媒体或格式中使用、分享、改编、分发和复制，只要您给予原作者和来源适当的署名，提供创作共用许可协议的链接，并说明是否有更改。本文中的图片或其他第三方材料包含在文章的创作共用许可中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料不包含在文章的创作共用许可中，并且您的预期用途不被法律法规允许或超出了允许的用途，您将需要直接从版权所有者那里获得许可。欲查看此许可证的副本，请访问gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用公共领域奉献放弃书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本文提供的数据，除非在数据的信用额度中另有说明。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba