CC-99677是一种新型口服选择性MK2共价抑制剂，可持续减少促炎细胞因子的产生

背景

丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)激活蛋白激酶-2 (MK2)在p38 MAPK的下游被激活，并调节编码炎症细胞因子的mrna的稳定性。CC-99677是一种新的、不可逆的、共价MK2抑制剂，正在开发中，用于治疗强直性脊柱炎(AS)和其他炎症性疾病。作为评估安全性和耐受性的I期临床试验的一部分，我们评估了CC-99677的靶点接触、药代动力学和药效学。

方法

研究评估了MK2抑制剂CC-99677对健康供者和确诊AS患者外周血单个核细胞(PBMCs)细胞因子表达的影响。建立了一种新的体外模型来比较CC-99677和p38抑制剂在THP-1细胞中的速敏反应潜力。在受刺激的人单核细胞来源的巨噬细胞中评估CC-99677对trstetrprolin (TTP)和细胞因子mRNA的影响。在首次人体试验中，37名健康志愿者被随机分配每日口服CC-99677或安慰剂，并在给药前后预先指定的时间点采集血液。评估血浆中CC-99677的浓度，评估pbmc中CC-99677与MK2的结合。在首次人体研究中，对参与者的全血进行体外刺激，以评估药效学效果。

结果

体外实验中，CC-99677通过一种信使rna不稳定机制抑制了来自AS患者和健康志愿者的单核细胞和巨噬细胞样本中肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)-6和IL-17蛋白的产生。在体外快速耐药模型中，CC-99677与p38抑制剂相比显示出持续TNF蛋白抑制的分化模式。CC-99677在脂多糖刺激的巨噬细胞中减少TTP磷酸化，加速炎症细胞因子mRNA的衰减。给健康志愿者使用CC-99677是安全且耐受性良好的，具有线性药代动力学和体外全血TNF、IL-6和趋化因子合成的持续降低。

结论

CC-99677抑制MK2是治疗炎症性疾病的一种有前途的方法，可能克服p38 MAPK抑制的局限性。

试验注册

ClinicalTrials.govNCT03554993．

脊椎关节炎包括一组炎症性风湿性疾病，其特征为脊柱和周围关节少聚关节炎和关节炎，并可能与粘膜皮肤、眼部和/或心脏共病有关[1］．这些疾病的治疗包括非甾体抗炎药物作为一线治疗，并考虑对无反应的患者使用靶向细胞因子的生物制剂，如肿瘤坏死因子(TNF)和白介素(IL)-17 [2］．尽管TNF和IL-17抑制剂已证实可改善强直性脊柱炎(AS)患者的疾病相关参数，但其对影像学进展的影响尚不明确[3.，4］．因此，解决疾病相关参数和影像学进展的新治疗方法的需求尚未得到满足。

p38-丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号通路在应激介导的促炎细胞因子(TNF、IL-6和IL-1β)的产生中起着中心作用，p38-MAPK抑制剂已被广泛研究用于炎症疾病的治疗[5，6，7］．p38-MAPK有近百种已知底物，包括激酶、转录因子和调控因子、细胞周期调控因子和其他mapk [8］．由于肝毒性、心脏毒性和缺乏疗效，具有自身免疫性疾病相关适应症的p38-MAPK抑制剂在临床开发中未能取得进展[5，7，9，10］．

p38-MAPK抑制剂与类风湿关节炎和其他炎症性疾病患者的速过敏反应有关，在这些患者中，尽管继续治疗，但c反应蛋白(CRP)等炎症标志物的早期降低并未持续[5，9，11］．观察到的快速过敏反应可能是由p38的多效性作用解释的，p38- mapk的抑制可能导致代偿机制的激活。例如，已经观察到p38抑制可以激活上游激酶MAPK激酶4和7 (MKK4/7)，并抑制负性MAPK调节剂双特异性磷酸酶1 (DUSP1)，它可以抑制包括p38-MAPK在内的多个MAPK [12，13］．因此，作为一种避免靶向p38-MAPK固有局限性的手段，p38-MAPK下游蛋白已被确定为炎症疾病的新靶点。

mapk活化蛋白激酶-2 (MK2)是p38的直接下游靶点，被认为是炎症性疾病的一个有前途的靶点。激活MK2增加促炎因子(如TNF、IL-1β、IL-6) mRNA的稳定性和翻译[14，15，16］．MK2在转录后水平上的作用是由三stetraprolin (TTP)介导的，TTP是一种锌指结合蛋白，它与3 '非翻译区(utr)的AU-rich元素(ARE)结合[17］．TTP通过招募死烯酶，使3 ' utr中含有ARE的多种细胞因子的mRNA不稳定，包括TNF、GM-CSF、IL-10、IL-6和它自己的mRNA，导致一个自动调节的负反馈循环[18，19，20.］．人抗原R (Human antigen R, HuR)是一种rna稳定蛋白，通过竞争与ARE结合和促进翻译，起到与TTP相反的作用。激活的MK2磷酸化TTP并降低其对ARE的亲和力，从而允许HuR结合并通过稳定mRNA和增强翻译促进细胞因子的产生[17］．MK2敲除小鼠无法通过TTP稳定促炎细胞因子转录本，在各种炎症疾病模型中免受炎症的影响[15，21］．MK2抑制剂在关节炎和AS模型中已证明有效[21，22，23］．

在这里，我们描述了使用AS患者和健康志愿者的外周血单个核细胞(PBMCs)进行的体外研究，以分析CC-99677对促炎蛋白的影响。为了阐明CC-99677对细胞因子产生的作用机制，我们研究了它对巨噬细胞TTP磷酸化和细胞因子mRNA衰变的影响。我们在THP-1细胞中通过一种新的体外试验探索药物暴露与速耐电位之间的关系，并对比CC-99677活性与p38抑制剂活性。我们还报告了来自第I期首次在人(FIH)多次上升剂量(MAD)研究的数据，以表征CC-99677在健康志愿者中治疗的安全性、药代动力学(PK)和药效学(PD);其他地方报告了单次剂量上升的数据[23，24］．

从健康和AS患者样本中培养pbmc

来自Bio-Options (Brea, CA)的健康志愿者和AS患者的人体pbmc被解冻并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗。脂多糖(LPS)刺激用添加10%胎牛血清(FBS)和青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基培养细胞。用二甲基亚砜(DMSO;0.25%)或CC-99677分别以0.3、1和3 μM培养1 h，然后以LPS以50 ng/mL培养24 h。在葡萄球菌肠毒素- b (SEB)/IL-2处理的情况下，细胞在RPMI 1640培养基中培养3天，添加10%胎牛血清、1%谷氨酰胺、1% HEPES和青霉素/链霉素。所有细胞在37°C和5% CO中培养₂在加湿的培养箱里。收集并冷冻培养基，用于细胞因子和趋化因子评估。

每日用CC-99677或p38抑制剂治疗THP-1细胞

THP-1细胞以1.0 × 10的剂量接种⁶细胞/mL，并使其适应24 h。每天测量细胞计数和活力，以监测细胞数量和健康。维持细胞数量在1.0 × 10左右⁶细胞/mL，细胞每隔一天分裂一次。每天添加p38抑制剂(BMS-582949、BIRB-796和SCIO-469)、MK2抑制剂CC-99677或DMSO，以保持持续接触，直到样品收集时间。分别于第0天、第1天、第3天、第6天、第9天、第12天和第14天采集样品。在每个时间点，用100 ng/mL LPS刺激细胞24小时，以模拟在临床中进行的体外试验，并使用酶联免疫吸附试验(ELISA;猫。不。18421，阿伯卡姆，剑桥，麻州)。

ELISA法细胞因子分析

将培养上清离心，收集上清并用Milliplex Magpix测定法分析所选细胞因子和趋化因子(目录HCYTO - 60K;Millipore Sigma, Burlington, MA)。根据制造商的建议，使用特定的ELISA试剂盒(研发，NJ, USA)量化单核细胞和巨噬细胞的促炎细胞因子TNF和MCP-1水平。数据处理采用Milliplex Analyst，显著性计算采用单因素方差分析(ANOVA)，采用GraphPad Prism版本5.01中的Dunnett后测算法。

将人单核细胞分化为巨噬细胞

用Ficoll梯度法从棕黄皮中分离PBMCs。单核细胞分离使用STEMCELL Technologies Inc.试剂盒(目录编号19058;温哥华,加拿大BC)。用50 ng/mL的巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)刺激5天，然后用50 ng/mL的干扰素γ (IFNγ)刺激约16小时，将单核细胞分化为巨噬细胞。然后，巨噬细胞被包裹，让其适应24小时。

评估CC-99677对细胞因子和TTP的影响

单核细胞和巨噬细胞用DMSO或化合物预处理1小时，然后用LPS (100 ng/mL)刺激4或24小时(包括1小时预处理)。从培养的巨噬细胞培养基中使用Magpix磁珠进行细胞因子分析(目录HCYTO - 60K;Millipore Sigma, Burlington, MA)。收集巨噬细胞培养的细胞球进行western blot分析，用毛细管电泳分析对TTP的影响，甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)被用作毛细管电泳中的管家蛋白。分别用抗总TTP (CST#7162兔单克隆抗体)和抗GAPDH (CST#5174兔单克隆抗体)抗体检测相应蛋白。

评估巨噬细胞mRNA的稳定性

用LPS刺激M-CSF和ifn - γ向巨噬细胞分化的单核细胞3 h，然后在37℃下用10 μg/mL放线菌素D在1 μM CC-99677或DMSO存在下处理0 h、10 min、30 min、1、2、4、5、6 h。在每个时间点后，巨噬细胞用PBS洗涤，并用RLT +裂解缓冲液(Qiagen, Germantown, MD)裂解。使用QiaCube分离RNA，然后使用Superscript IV酶混合物制备cDNA (Invitrogen, Thermo Fisher, Waltham, MA)。用逆转录聚合酶链反应检测放线菌素D和CC-99677对mRNA的衰减速率肿瘤坏死因子，il - 6,il - 1β使用GAPDH作为一种家庭管理基因。

临床研究设计

2018年5月至2019年7月在英国进行了一项单中心、随机、双盲、安慰剂对照I期研究(NCT03554993)，其中包含MAD成分。37名来自不同种族、民族或性别的健康志愿者参与了研究。纳入标准为18 ~ 55岁(含)，体重指数18 ~ 33 kg/m²，由研究者进行体格检查，无临床显著发现。如果受试者存在任何临床显著病史、实验室异常、精神疾病或其他可能使受试者因参与研究而面临不可接受的风险的情况，则排除受试者。根据临床试验促进小组的建议提供预防怀孕指导[25］．受试者被随机分配每日口服CC-99677或安慰剂剂量。受试者每天给药，持续14天。CC-99677或安慰剂有5个剂量递增队列，从10到150 mg不等。研究者和实验对象都对治疗臂视而不见。采用MedDRA 22.0版本和美国食品和药物管理局(FDA)健康成人和青少年志愿者毒性分级量表进行了安全性评估，包括体格检查、临床实验室测试和不良事件收集，并对其进行了分级[26］．该试验的主要结果是CC-99677的安全性和耐受性。次要的和探索性的结果包括PK概况的评估和CC-99677 PD效应的评估，通过测量MK2占用率和炎症细胞因子体外抑制。

目标接触分析

在pbmc中使用链霉菌亲和素质量转移(SMaSh)法测量MK2的靶结合，该方法旨在表明共价结合CC-99677占用和未占用MK2的数量[23，27］．在预定的时间点采集血液进行PBMC分离，在第1、2、3、5、7和14天给药之前，然后在第15、17、21和28天最后一次给药之后。在指定的队列剂量条件下，评估样本中与CC-99677结合的MK2的百分比与PBMCs中游离的MK2的百分比。通过计算与基线相比百分比界限MK2的变化来衡量目标敬业度。

药代动力学评价

采集血液，在预定时间点测定CC-99677血浆浓度，进行强PK采样。使用有效的液相色谱串联质谱法测定血浆中CC-99677的浓度。PK参数采用Phoenix版本7或更高版本(普林斯顿，新泽西州)的非隔室方法计算。

药效学评价

通过体外评估LPS刺激后细胞因子和趋化因子的产生来评估CC-99677对固有细胞活性的影响。在给药前的第1、2、3、5、7和14天，最后一次给药后的第15、17、21和28天，使用TruCulture®检测系统(Myriad RBM, Austin, TX)对采集的全血样本进行体外刺激。简单地说，血液(1ml)被抽到含有lps的结构培养管中。管子被放置在37°C的块恒温器中24±1小时，然后在−70°C冷冻。分析混合血浆的培养基中TNF和其他细胞因子/趋化因子的水平。体外lps刺激的血液中TNF的抑制作用以TNF水平与基线相比的百分比变化来衡量。在体外刺激试验中，也测量了相对于基线水平的其他细胞因子和趋化因子的百分比变化。

CC-99677抑制AS患者PBMCs中细胞因子的产生

我们之前已经证明CC-99677抑制lps刺激的健康供体PBMCs产生炎症细胞因子，包括TNF、IL-6和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) [23］．我们研究了CC-99677在AS患者样本中的作用，并观察到在lps刺激的PBMCs中有类似浓度依赖性的TNF生成抑制(图。1A).因为GM-CSF可能启动来自AS患者的PBMCs和单核细胞以增加TNF的产生，我们也确定了CC-99677对GM-CSF产生的影响[28，29］．CC-99677抑制AS患者PBMCs中的GM-CSF至与健康志愿者相似的水平(图1)。1B)。

为了扩展这些发现，我们用SEB和IL-2刺激PBMCs，以确定t细胞激活下游的细胞因子产生的影响。在该模型中，CC-99677抑制了健康供体和AS患者PBMCs中TNF、IL-17A、IL-6和单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1)的表达(图1)。2)．

抑制MK2减少了lps刺激的单核细胞和巨噬细胞中细胞因子的产生

单核细胞等髓系细胞是as中TNF、IL-23和其他炎症细胞因子的关键生产者[30.，31］．鉴于其关键的促炎作用，我们试图确定CC-99677对lps刺激的单核细胞和巨噬细胞的影响。巨噬细胞由单核细胞衍生，经M-CSF和ifn - γ处理后分化为促炎M1型。CC-99677在单核细胞和巨噬细胞中均表现出强烈的浓度依赖性TNF抑制作用(图。3.A). CC-99677还表现出浓度依赖性抑制单核细胞和巨噬细胞中IL-6和IL-1β的分泌，尽管CC-99677对细胞因子分泌的抑制作用在巨噬细胞中更强(图1)。3.一个)。

CC-99677通过抑制TTP磷酸化促进细胞因子mRNA的衰变

为了确认MK2抑制下游的细胞因子抑制机制，我们评估了CC-99677对TTP磷酸化状态和细胞因子mRNA稳定性的影响。我们使用抗TTP抗体通过毛细管电泳来研究蛋白质水平的影响。虽然尚无磷酸-TTP特异性抗体，但TTP总蛋白水平可作为TTP磷酸化状态的替代品。TTP的稳定性和总丰度受MK2的磷酸化调节:当TTP被去磷酸化时，它变得不稳定，因此TTP总蛋白水平降低[20.］．正如预期的那样，LPS刺激巨噬细胞导致TTP磷酸化，反映为TTP丰度的增加。3.B).值得注意的是，CC-99677处理导致总TTP水平的剂量依赖性降低，表明磷酸化状态降低。然后我们评估CC-99677抑制TTP磷酸化对细胞因子mRNA稳定性的影响。含are的mRNA衰变肿瘤坏死因子，il - 6,il - 1β在lps刺激的巨噬细胞中测定了放线菌素D单独存在和与CC-99677联合存在的转录物。各促炎基因转录本的表达归一化为GAPDH信使rna。单用放线菌素D可观察到细胞因子mRNA水平随时间的推移而下降;然而，放线菌素D和CC-99677联合使用，与单独使用放线菌素D相比，mRNA的衰减明显更大。3.C)。

CC-99677持续抑制体外TNF，但p38抑制剂无效

在使用p38抑制剂的临床研究中，促炎标志物如CRP的早期降低在治疗期间没有持续。炎症标志物水平早在治疗后2周就出现反弹，提示过敏反应快[5，7，9，10］．我们试图开发一个持续抑制剂治疗的模型，以确定体外速反应的潜力。每天用p38抑制剂或CC-99677处理THP-1细胞，持续14天。在治疗期间的不同时间，LPS刺激了不同的细胞。正如预期的那样，在治疗期间的早期，p38抑制剂阻断了lps刺激的TNF的产生(图。4)．然而，从第9天开始，所有测试的p38抑制剂(BMS-582949, BIRB-796, SCIO-469)都发现TNF抑制作用的丧失。与p38抑制剂相比，CC-99677在整个治疗期间抑制了TNF的产生。这些数据表明，MK2抑制可能会绕过与p38抑制剂相关的速敏反应。

CC-99677在多次上升剂量研究中是安全且耐受性良好的

CC-99677在体外和体内的作用支持在健康志愿者中启动FIH临床研究[23］．CC-99677单次上升剂量的PK和PD已有报道[23］．研究的MAD部分的结果报告在这里。37名健康成人(67.6%男性，32.4%女性，89.2%白人)，平均年龄34岁(20-55岁)，平均体重指数26.08公斤/米²(范围20-33)完成每日一次的多剂量研究。除了轻微的性别失衡外，服用CC-99677的受试者和服用安慰剂的受试者之间的人口统计学数据具有可比性1:表S1)。

在连续14天的给药后，在CC-99677的5个剂量水平队列(10 - 150mg)中，37名受试者均未观察到严重的治疗紧急不良事件(teae)。没有受试者因为安全原因而停止MAD研究。根据FDA毒性分级量表，研究者将MAD研究中所有teae分级为轻度(1级)[26］．完整的TEAE清单如表所示1．77.8%接受安慰剂的受试者发生teae，而接受CC-99677的受试者发生teae的比例为46.4%1；无花果。1A).没有观察到CC-99677对teae发生率的明显剂量依赖性(表1；无花果。1B).最常报告的TEAE为轻度头痛(n= 5)，其次为轻度肌痛(n=(表3)1；无花果。1C).以盲法进行因果关系评估;根据研究者的评估，TEAE与研究药物的疑似关系显示，大多数(69%)的ae不怀疑与CC-99677相关(图S1D).在被怀疑与研究药物相关的ae之间没有趋势。

CC-99677具有线性和可预测的PK谱

CC-99677的多剂量PK特性显示，浓度和暴露量呈线性、剂量成比例增加，从10到150 mg，每天给药一次，持续14天。几何平均峰值浓度(C_马克斯第1天，CV%分别为20.5(51.4%)、63.4(22.1%)、150(66.4%)、269(44.7%)和257 (37.1%)ng/mL，剂量分别为10、30、60、120和150 mg。在所有5个剂量水平下，药代动力学曲线显示，给药24小时后血浆CC-99677 >的可检出量极小，这表明CC-99677的每日血浆积累有限，几乎为零[23］．与这一发现一致的是，在(1)第1天剂量峰值或总暴露量与(2)达到目标接触稳态时峰值和总暴露量之间未观察到显著差异[32］．几何均值C_马克斯在150 mg剂量水平对应的CC-99677的浓度约为0.8 μM。该浓度落在临床前体外试验中发现TNF和其他细胞因子显著抑制的范围内。

使用CC-99677的健康志愿者pbmc中的MK2靶参与

SMaSh试验区分了游离的MK2和CC-99677结合的MK2的水平，证明了口服CC-99677的健康志愿者PBMCs裂解液中CC-99677的共价结合是时间和剂量依赖性的。5)．CC-99677显示MK2占用率在10 - 120mg之间呈剂量依赖性增加，在120- 150mg剂量水平有一个平台期。MK2的平均使用率从10mg剂量组第8天的28%上升到120mg和150mg剂量组的约70%(图1)。5)．CC-99677的MK2占用率稳定到第15天(最后一剂后1天)，并在最后一剂后14天恢复到基线水平。

在证明了每日给药累积增加靶点接触后，我们试图评估体外外周血刺激试验中对细胞因子产生的影响。为了确保细胞因子的改变不是由于CC-99677剂量引起的外周血细胞数量的变化，我们比较了活性组和安慰剂组之间的白细胞、单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞总数。总白细胞(WBC)、淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞计数从给药前基线监测到14天的每日给药期。在150mg CC-99677中，> 70% MK2靶点被观察到，WBC、淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞计数的平均值(标准差[SD])与安慰剂相当，没有受试者的绝对中性粒细胞计数(ANC)诊断为中性粒细胞减少症(ANC < 1.5 × 10)⁹细胞/ L)(无花果。6模拟)。

CC-99677给药可持续抑制健康志愿者体内lps刺激的细胞因子产生

CC-99677在所有剂量> 10 mg时都能抑制TNF，并且这种抑制持续到第14天(图。7A).在60、120和150 mg剂量组中，TNF的产生早在第2天就减少了。在150 mg剂量队列中，TNF的最大抑制为70%，并在给药期间始终保持在约70%(图。7B). CC-99677抑制了其他细胞因子和趋化因子，但与TNF抑制相比，观察到更多的可变性。巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-1α和MIP-1β在连续剂量为120和150 mg时被抑制(图。7C, D)。IL-6的产生尤其表现出显著的可变性，这可能反映了IL-6水平的日效应[33］．尽管有这种可变性，IL-6在150毫克剂量水平上被明显抑制(图。7E).在第5天，150 mg剂量水平的队列观察到IL-6和MIP-1α的最大抑制率为50%。

p38激酶抑制剂已被探索为潜在的抗炎疗法，但其开发受阻于不利的安全性和耐速反应的证据[5，9］．我们已经描述了CC-99677在AS患者PBMCs中的抑制谱，这些PBMCs被LPS或SEB/IL-2刺激，以评估体外固有免疫细胞和适应性免疫细胞中MK2抑制的效果。PBMCs的LPS刺激侧重于评估髓系反应，而SEB刺激侧重于抗原呈递细胞(APCs)和t细胞的反应，通过与APCs和t细胞受体上的II类主要组织相容性复合体蛋白结合，在β链的可变区域[34］．CC-99677抑制lps刺激PBMCs中的TNF和GM-CSF，抑制SEB/ il -2刺激PBMCs中的TNF、IL-6、IL-17A和MCP-1。CC-99677在m1极化巨噬细胞中对TNF、IL-6和IL-1β细胞因子的产生有强烈的浓度依赖性抑制作用，在单核细胞中也有类似的抑制作用，尽管效果略弱。巨噬细胞和单核细胞中IL-1β的抑制与PBMCs中观察到的IL-1β的抑制形成对比，在PBMCs中，LPS刺激后未观察到IL-1β的抑制，这表明来自单核细胞的促炎巨噬细胞经M-CSF和ifn - γ处理后对MK2抑制的敏感性增加[23］．

CC-99677抑制的细胞因子和趋化因子群可能与包括AS在内的炎症性疾病有翻译相关性。TNF和IL-17A阻断治疗AS有效[2］．活动性AS患者循环中IL-6水平升高，与疾病活动性相关，并可能预测对TNF抑制的治疗反应[35，36］．AS患者血清中MCP-1水平升高，可将机械性腰痛与AS患者区分开来;此外，在AS患者的滑膜样品中MCP-1及其受体CC趋化因子受体2的表达增加[37，38］．此外，在巨噬细胞中的抑制作用表明，在M-1型巨噬细胞分泌大量促炎细胞因子的炎症环境中，CC-99677可能能够有效抑制炎症[39］．巨噬细胞已被确定为主要的炎症细胞类型，浸润在as患者样本的肠封部位[40］．这支持了CC-99677可能对炎症性疾病有效的观点，如as，对这些疾病，抗TNF和IL-17的生物制剂已显示出疗效，并已被批准为治疗药物[41］．

TNF和其他细胞因子的表达在转录后水平上由p38/MK2通路通过TTP控制[17］．MK2在LPS刺激后磷酸化TTP的S52和S178位点，并提高其稳定性[20.］．正如预期的那样，MK2抑制导致TTP磷酸化减少，这反映在lps刺激的巨噬细胞中TTP丰度的减少。未磷酸化的TTP将死酶招募到含有are的mrna上[19］．事实上，在我们的研究中，放线菌素D治疗表明cc -99677介导的TTP磷酸化抑制导致细胞因子mrna的衰减增加。这些结果支持CC-99677作为MK2抑制剂的机制，通过刺激ttp介导的含有are的细胞因子mRNA的衰变来阻止细胞因子的产生。未来的研究将探讨CC-99677在ttp介导的翻译抑制中的作用。

在多种p38抑制剂的临床试验中，快速过敏反应一直是一致的发现。尽管持续给药p38抑制剂，炎症标志物的最初降低并未持续[5，7，9，10］．我们在THP-1细胞中建立了一种新的体外速敏反应模型，模拟在体外环境中连续暴露。该模型被用于确定CC-99677的速敏反应潜力，并与p38抑制剂进行比较。CC-99677，而不是p38抑制剂BMS-582949, BIRB-796和SCIO-469，在14天的试验中持续抑制THP-1细胞中TNF的分泌，这表明可能存在防止p38而不是MK2抑制剂表现出持续抑制的反馈途径。虽然这种差异的机制尚不清楚，但先前在THP-1细胞、巨噬细胞和滑膜细胞中的研究表明，在使用p38抑制剂SB203580和VX-745治疗时，c-Jun n -末端激酶(JNK)被激活，而使用MK2抑制剂PH089则没有[12，13］．此外，据报道，p38抑制可以破坏DUSP1的负反馈，DUSP1是一种被p38磷酸化激活并去磷酸化JNK的磷酸酶[42］．据报道，p38抑制剂可通过阻止TAK1结合蛋白(TAB1)的磷酸化和延长TAK1活性来增加JNK的激活[43］．因此，使用p38抑制剂观察到的快速过敏反应可能归因于p38在控制炎症反应中施加的负反馈被破坏。未来的研究将探讨MK2抑制对这些反馈途径的不同影响。

CC-99677对健康成年志愿者的耐受性良好，每天口服给药1次，超过2周，所有的不良事件性质轻微，大多数不怀疑与CC-99677有关;这些观察结果与其他MK2抑制剂的耐受良好的FIH图谱相似[44，45，46］．尽管MK2的持续共价结合，CC-99677对多细胞因子的抑制似乎并不是外周血WBC或WBC亚群减少的原因或结果。鉴于CC-99677抑制GM-CSF、TNF和IL-6产生的机制，CC-99677给药2周后无中性粒细胞减少是令人鼓舞的，因为GM-CSF在干细胞分化为中性粒细胞方面很重要，TNF和IL-6阻断都与剂量依赖性中性粒细胞减少有关[47，48］．尽管如此，仍需要对患者进行更大规模的研究，以确认这里介绍的初始安全性;一项针对AS患者的II期研究(NCT04947579)已经启动，以衡量其安全性和有效性。

正如不可逆共价抑制剂所预期的那样，随着时间的推移，CC-99677对MK2的占用随着每日剂量的增加而增加，在第5天到第8天之间达到剂量依赖的稳定状态。CC-99677的药效与体外细胞因子抑制呈剂量依赖性关系。重要的是，CC-99677对TNF的抑制持续了14天的治疗期，这与报道的p38抑制剂BCT197失去效果形成对比，使用了类似的试验和临床研究设计。值得注意的是，另一种MK2抑制剂ATI-450(原CDD-450)在新生儿多系统炎症性疾病(NOMID)小鼠模型中显示出lps诱导的TNF在给药后长达4周的抑制作用，而p38α全局抑制剂CDD-111(也称为SD-0006)则没有[49］．总的来说，这些证据表明MK2抑制可能绕过反馈通路，当p38抑制引起反馈通路时，会导致过速反应和短暂药效，阻碍了p38抑制剂的临床开发。然而，需要在疾病背景下进行较长时间的临床研究来证实这些发现。

由于实验和FIH研究是体外和体外评估，这些发现不能完全外推到促炎细胞因子水平内源性升高患者的结果。需要在大量患者队列中进行II期和III期研究，以确认FIH经验提示的结果。然而，CC-99677的作用在不同的实验条件下是一致的，体外和体外试验是可复制的。

20世纪90年代末至2010年代中期期间，以单一细胞因子或其相关受体为靶点的生物蛋白的美丽新世界占据了主导地位，而最近风湿病、皮肤病和其他炎症疾病的药物发现和开发则以小分子多细胞因子抑制剂为标志。这些方法可以提高疗效和方便性。例如，抑制JAK-STAT通路已成为包括类风湿关节炎、银屑病关节炎和炎症性肠病在内的几种疾病的可行治疗方案[50］．在AS中也出现了有希望的III期数据[51］．然而，JAK抑制剂存在一些安全责任，严重感染的风险增加，静脉血栓栓塞事件的发生率更高;因此，需要替代方案[52］．随着处方者和患者越来越倾向于安全有效的口服方案，而不是注射或不可注射的治疗，每日一次的口服多细胞因子抑制CC-99677作为单一疗法或与其他口服药物联合使用，为新治疗范式的时代带来了希望。暴露于CC-99677的人细胞在体外和体外试验中观察到缺乏速敏反应，与早先针对p38轴的令人失望的尝试相比[7，53]，这是令人鼓舞的发现，并表明MK2抑制可能盛行于历史上p38直接抑制失败的地方。

FIH研究的结果，以及体外和体外对CC-99677的表征表明，抑制MK2可以有效降低as病理生理相关的炎症细胞因子和趋化因子。CC-99677的安全性和耐受性谱、线性PK谱以及导致体外持续抑制炎症相关细胞因子的高度靶点参与表明，在未来的临床研究中进一步研究CC-99677的治疗潜力是值得的。

百时美施贵宝的数据共享政策可参阅https://www.bms.com/researchers-and-partners/independent-research/data-sharing-request-process.html．

AE:

不良事件

非洲国民大会:

绝对中性粒细胞计数

方差分析:

方差分析

APC:

抗原递呈细胞

是:

AU-rich元素

为:

强直性脊柱炎

C_马克斯：

峰浓度

c反应蛋白:

c反应蛋白

DMSO溶液:

二甲亚砜

DUSP1:

Dual-specificity磷酸酶1

ELISA:

酶联免疫吸附试验

的边后卫:

胎牛血清

gm - csf:

集落刺激因子

户珥:

人工抗原R

富士康:

First-in-human

干扰素γ：

干扰素γ

IL:

白介素

物:

小君n端激酶

有限合伙人:

脂多糖

MAPK:

增殖蛋白激酶

疯了:

多个提升剂量

MCP-1:

单核细胞化学引诱物蛋白1

MIP:

巨噬细胞炎性蛋白

MKK4/7:

MAPK激酶4/7

MK2型:

丝裂原活化蛋白激酶-活化蛋白激酶-2

PBMC:

外周血单个核细胞

帕金森病:

药效学

PK:

药物动力学

PBS:

磷酸盐

SD:

标准偏差

SEB:

葡萄球菌enterotoxin-B

粉碎:

链霉亲和素质转变

TAB1:

TAK1-binding蛋白质

TEAE:

治疗诱发的不良事件

TTP:

Tristetraprolin

肿瘤坏死因子:

肿瘤坏死因子

UTR:

未翻译区

白细胞:

白血细胞

我们要感谢参加临床试验的健康志愿者。我们要感谢史蒂文·格林伯格医学博士;博士埃琳娜·柯斯登柯;菲利普中博士;刘连刚博士负责审稿并提供指导。由百时美施贵宝资助的Peloton Advantage有限责任公司的药学博士Amy Zannikos提供写作和编辑协助。

这项研究得到了百时美施贵宝的支持。

作者指出

1. Rajula gar和Kofi A. Mensah是共同第一作者。

作者和联系

1. Bristol Myers Squibb，普林斯顿，美国新泽西州

   Rajula Gaur, Kofi A. Mensah, Jason Stricker, Mary Adams, Anastasia Parton, Dorota Cedzik, Jamie Connarn, Michael Thomas, Gerald Horan, Peter Schafer, Maria Palmisano & Francisco Ramírez-Valle

2. 商学，诺丁汉，英国

   斯图尔特更好的

作者指出

1. 杰森·斯特里克、多洛塔·塞齐克、杰米·康纳恩和玛丽亚·帕米萨诺在研究期间都隶属于百时美施贵宝。

贡献

FRV、KAM和SM设计了临床试验。SM是临床研究研究员。KAM招募了患者。RG, KAM和FRV准备了手稿。所有作者都对数据的收集、汇编、分析和解释做出了贡献，并对最终稿件做出了贡献。

相应的作者

对应到旧金山Ramirez-Valle．

伦理批准和同意参与

临床研究方案、知情同意文件和其他研究相关文件由伦敦-河滨研究伦理委员会(独立伦理委员会)和英国药品和保健产品监管局(MHRA)审查和批准。这项研究是按照《赫尔辛基宣言》、国际协调理事会良好临床实践指南以及适用的区域和国家法规要求进行的。

同意出版

所有研究对象在开始任何特定研究程序之前都提供了书面的知情同意。

相互竞争的利益

RG、KM、JS、MA、SP、MT、GH、PS、MP和FRV都是百时美施贵宝的员工和股东。JC和DC是百时美施贵宝的前雇员和股东。SM是商科学的员工和股东。

出版商的注意

卡塔尔世界杯常规比赛时间施普林格自然对出版的地图和机构附属的管辖权要求保持中立。

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