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利用T细胞激活相关基因共表达网络评估大动脉炎患者的疾病活性

摘要

背景

一直缺乏可靠的血清生物标志物来评估大动脉炎(TAK)的疾病活性。本研究旨在通过检测外周单个核细胞(PBMCs)的基因表达水平来评估TAK的疾病活性。

方法

采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测活性TAK患者、非活性TAK患者和健康对照组PBMCs中T细胞激活关键基因的表达水平,包括TCR、CD28、CD40、CD40L、PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIGIT、TIM3、LAG3、CCL5、T-bet、RORC和FOXP3。建立基因共表达网络,提取活性TAK患者与非活性TAK患者的拓扑结构特征并用公式描述。分别以ESR、CRP、IL-6、TNF-α等常规血清生物标志物、TCR、CD28、T-bet、RORC基因表达水平及拓扑结构特征评价疾病活动性,并比较诊断疗效。

结果

与无活性TAK组相比,活性TAK组在由T细胞激活所必需的基因组成的网络中具有更大的聚类系数。利用该拓扑结构特征评价疾病活动性时,敏感性为90.9%,特异性为100%,AUC为0.98,大于这些生物标志物的AUC。

结论

拓扑结构的特征可以区分活跃TAK患者和非活跃TAK患者。这可能是一种新的疾病活动性评估算法。

背景

大动脉炎(TAK)是一种原发性大血管炎。这是一种慢性、复发和进行性自身免疫性疾病,因此在随访期间准确评估疾病活动是非常重要的。但一直缺乏经验证的TAK疾病活度综合测量方法[1].临床上最广泛使用的TAK疾病活性标志物是红细胞沉降率(ESR)、c反应蛋白(CRP)、白细胞介素(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α),但它们都不是很可靠。例如,一项研究表明,在诊断为活动性的TAK患者中,28%的ESR正常,而在诊断为缓解期的TAK患者中,43%的ESR升高[2].此外,我们对428例TAK患者的前瞻性研究显示,ESR、CRP、IL-6和TNF-α的敏感性分别为41.9%、63.5%、56.1%和48.2%,特异性分别为88.1%、88.7%、85.8和60.3% [3.].

此外,还有其他潜在的血液生物标志物可用于监测TAK的进展[4],如penttraxin -3 [5], YKL-40 [6], MMP-9 [7], MMP-3 [8),瘦素(9]和血清淀粉样蛋白A [9].然而,这些生物标志物的诊断效果尚未得到临床验证。最近,三项研究表明,血清补体是评估TAK(包括C3)疾病活性的潜在生物标志物[10], C1q [11]和C4a [12].C3的敏感性为69.9%,特异性为66.7%,曲线下面积(AUC)为0.715 [10], C1q的敏感性为77.8%,特异性为64.9%,AUC为0.752 [11].一项研究报道,血清趋化因子是评估TAK、CCL2、CCL20、CXCL8和CXCL10疾病活动性的潜在生物标志物,其敏感性/特异性分别为66.7%/67.2%、54.2%/77.1%、70.8%/72.1%和83.3%/54.1% [13].从这些研究中,似乎很难找到一个单一的血液生物标志物具有可靠的诊断功效。

在本研究中,我们尝试了一种新的算法,利用基因共表达网络的拓扑结构来评估TAK患者的疾病活动性,因为我们观察到活跃TAK患者的基因共表达网络中有许多显著的签名不同于非活跃TAK患者。此外,我们比较了三种方法的诊断效果,包括基因共表达网络的拓扑结构、血清生物标志物(ESR、CRP、IL-6和TNF-α)和基因mRNA水平(TCR、CD28、T-bet和RORC)表达。

方法

病人

接受治疗的TAK患者符合1990年ACR标准[14)注册。我们根据1994年NIH标准评估了TAK的疾病活动[15],其中包括:

  1. 1.

    全身特征,如发热、肌肉骨骼(未发现其他病因)

  2. 2.

    ESR升高

  3. 3.

    血管缺血或炎症的新发作或加重特征,如跛行、脉搏减弱或无脉、杂音、血管痛(颈动脉痛)、上肢或下肢(或双侧)血压不对称

  4. 4.

    典型的血管造影功能

如果TAK患者有两个或两个以上的特征,他被定义为“活跃TAK患者”;否则诊断为缓解期,定义为“不活跃TAK患者”。

所有参与者都获得了书面知情同意,研究按照《赫尔辛基宣言》进行。该研究获得了中国北京协和医院机构审查委员会(S-478)的批准。

采集和处理人体血液样本

采用密度梯度离心法分离患者外周血单个核细胞(PBMCs)。使用Trizol试剂(15596026,赛默飞世尔科学公司)从pbmc中制备总RNA [16].RNA样品在无rnase水中稀释,在65°C变性10分钟。用分光光度法测定RNA的浓度和纯度,用变性RNA凝胶电泳验证RNA的完整性。

实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)

RNA使用带有gDNA橡皮擦的PrimeScript™RT试剂试剂盒(RR047A, Takara)进行反转录。基因组DNA (gDNA)在42°C 2分钟内被清除。逆转录在以下条件下进行:37°C 15 min, 85°C 5 s。RT-qPCR反应使用iTaqTM通用SYBR®Green Supermix (725124, Bio-Rad)进行,引物列于补充表1.应用生物系统7900HT1的温度循环参数如下:95°C 30 s, 95°C 30 s, 56°C 30 s, 72°C 40 s,然后在72°C保持40 s。基因表达计算采用2−ΔΔCq方法。熔点曲线分析在65 ~ 95°C。hcc与TAK患者比较的内参基因为B2M和SDHA。用于相对RNA定量的内参基因仅在TAK患者中为YWHAZ和HPRT1。

建立疾病活动性评估模型

在获得表达数据(∆Cq值)后,分别为活性TAK组和非活性TAK组构建两个基因共表达网络。然后,提取活性TAK组与非活性TAK组的网络结构特征。用一组线性回归方程描述了网络结构的特征。并对每个样本对模型的过拟合程度进行了量化。建立模型并进行评估,如图5所示。1说明了这一点。

图1
图1

建模流程图。PBMC,外周血单个核细胞。巨细胞病毒感染达克,。ROC:受试者工作特征曲线。AUC,曲线下面积

建立基因共表达网络

根据任意两个基因之间的皮尔逊相关,基于基因表达相关性建立了两个基因共表达网络——一个来自活跃TAK患者,另一个来自不活跃TAK患者。一个P值小于0.05被认为是显著的。每个节点代表一个基因,每条边代表表达水平的相关性。使用Cytoscape V.3.7.2进行网络分析。

提取网络的结构特征

为了提取活性TAK组相对于非活性TAK组的网络结构特征,本研究对特征网络结构进行了挑战,满足以下两个条件:

  1. 1.

    由度变化值大于0的基因组成的

  2. 2.

    由代表皮尔逊相关性的边组成的r大于0.74和aP值小于0.01,且仅存在于不活跃的TAK组或活跃的TAK组中,作为特征边

基因的程度变化值

基因在共表达网络中的共表达度是该节点与其他节点连接的边数。度数变化值= degree活跃的不活跃的

在生物体中,基因形成分子网络,这些分子网络往往是模块化的,类似的模块结合起来发挥作用[1718].如果两个基因的表达水平之间存在线性相关性,那么这两个基因在功能上很可能是密切相关的[1920.].度是网络分析中最常用的拓扑度量之一。例如,枢纽基因的程度最高,有望在理解应力/条件下反应的生物机制方面发挥重要作用。因此,人们普遍认为度高的基因在维持网络功能方面起着重要作用。

建立基于特征拓扑结构的TAK疾病活性评估数学模型

数学模型由特征网络结构中各边的回归方程组成。接下来,我们评估每个个体样本对模式的过拟合程度。为了量化样本拟合模型的程度,引入了两个新的参数,包括M值总分.利用约登指数设置总得分的阈值,总得分超过阈值的患者被诊断为TAK活动期。

M值

为了确定单个样本的数据与回归线的拟合程度,我们计算了相对误差(RE)作为绝对误差(AE)与基因表达水平观测值的比值。声发射是预测值与观测值之差的绝对值。

值,它等于RE:

$ $ M = \ \中期离开({y} _ {\ mathrm{预测}\ \ mathrm {value}} - {y} _ {\ mathrm{观察}}\右)/ {y} _ {\ mathrm{观察}}\中期。$ $

每个样本的合格数据一一拟合每条回归线。的计算每个活跃或不活跃患者的值。然后,将患者按价值。阈值是用约登指数设定的,并在适当的时候进行调整。如果患者患有值小于阈值,如果患者患有值大于阈值。

总分

患者的总分为各评分之和价值。总分的门槛是用约登指数设定的。

利用血清生物标记物评估TAK的疾病活性

为了比较三种方法对TAK疾病活度的评估效果,包括数学模型、血清生物标志物和基因表达mRNA水平,我们按照上述相同的方法计算总分及其阈值。ESR、hs-CRP、IL-6、TNF-α的参考值见表2.同时还设置了生物标志物的总得分:如果患者的血清水平高于参考水平,则为1分,如果患者的血清水平低于参考水平,则为0分。患者的总得分是所有生物标志物得分的总和。

利用基因表达mRNA水平评估TAK的疾病活性

计算TCR、CD28、T-bet和RORC等基因的相对mRNA水平。阈值是使用约登指数设置的。如果患者的mRNA水平高于阈值,则为1分,如果患者的mRNA水平低于阈值,则为0分。同时还设置了基因表达水平的总得分,即所有生物标志物得分的总和。总分的门槛也是用约登指数设定的。生物标志物中缺失值的患者将被排除在该生物标志物的分析之外。

三种评价方法的评价与比较

计算各指标的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值。建立每种方法的接收机工作特征曲线(roc),并比较曲线下面积(AUCs)。

统计分析

采用Kolmogorov-Smirnov量表评估正常程度。正态分布连续变量以均数±标准差表示,非正态分布连续变量以中位数表示(四分位间)。卡方检验用于报告两个类别变量之间的关联。采用Mann-Whitney检验分析组间连续变量的差异。基因表达水平之间的相关性用Pearson相关系数表示。通过检验正态分布的标准化残差对模型进行验证。采用IBM SPSS统计V.23 (Armonk, New York, USA)进行统计分析。一个P值小于0.05被认为是显著的。

结果

病人

共纳入20例接受免疫抑制剂治疗的TAK患者(9例非活性TAK患者编号为#1 ~ #9,11例活性TAK患者编号为#10 ~ #20)和10例健康对照(hc)。活跃性患者临床表现为发热(9.1%)、关节痛(36.4%)、ESR升高(27.3%)、血管缺血或炎症新发或加重(如脉少或无脉、杂音)(54.5%)、多发大中型动脉狭窄及血管厚度新发(81.8%)。患者的人口学资料及临床特征列于表中1.hs-CRP、IL-6和TNF-α各有一个缺失值。其中8例(72.7%)活动性TAK患者ESR正常(0 ~ 20 mm/h), 7例(70%)活动性TAK患者CRP正常(0 ~ 8.00 mg/L), 8例(80%)活动性TAK患者IL-6正常(< 5.9 mg/L), 8例(80%)活动性TAK患者TNF-α正常(< 8.1 mg/L)。另一方面,1例不活跃的TAK患者(11.1%)ESR水平升高,2例不活跃的TAK患者(22.2%)TNF-α水平升高2).

表1高康动脉炎患者的人口学资料及临床特征
表2分别采用基因共表达网络的拓扑结构、血清生物标志物和基因表达水平对TAK患者的疾病活动性进行评估

活动期TAK患者TCR、CD28、GATA3、RORC、FOXP3 mRNA水平较活动期TAK患者升高

与无活性TAK患者相比,活性TAK患者PBMCs中TCR、CD28、GATA3和RORC mRNA水平升高。此外,与hc相比,TAK活动期患者PBMCs中PD-1、GATA3和p65 mRNA水平升高。值得注意的是,与hc相比,TAK组PBMCs中TCR、CD40和LAG3 mRNA水平降低,TAK组PBMCs中TCR、CD28、CD40、LAG3、RORC和FOXP3 mRNA水平降低,TAK组活性组PBMCs中CD40 mRNA水平降低。有趣的是,与不活跃的TAK患者相比,活跃的TAK患者的T-bet和这些免疫检查点基因的mRNA水平没有明显升高(图1)。2).

图2
图2

Takayasu’s arteritis (TAK)患者外周血单个核细胞中T细胞活化相关基因mRNA的相对表达水平。红线表示平均值。内参基因为B2M和SDHA。统计数据用曼-惠特尼计算U测试。*P <0.05。**P <0.01。NS,没有明显的

用线性公式描述了基因共表达网络的结构特征

分别为活性TAK组和非活性TAK组构建两个基因共表达网络(未见图),然后提取活性TAK组与非活性TAK组比较的网络结构特征,采用图所示算法建立评估模型。1.网络分析显示,与TAK不活跃组相比,TAK活跃组PD-L1、PD-1、LAG3、p65、CD3、GATA3、T-bet、CTLA4、CD40L、CD40水平升高,PD-L2、CCL5、TIGIT、FOXP3、RORC、TIM3、TCR水平降低(图1)。3.A).建立了由度变化值≥0的基因组成的基因共表达网络,活性TAK组具有显著的聚类系数(0.724)大于非活性TAK组(0.424)(图4)。3.B).我们将特征边定义为与皮尔逊相关的边r大于0.74和aP值小于0.01,共有12条特征边。为了对拓扑结构进行数学描述,采用线性回归方程对活性基团的特征边进行描述。3.C).为了直观地显示结果,将活动患者和非活动患者的代表点映射到同一个坐标系中。从图中可以看出,代表活跃TAK患者的红点比代表不活跃TAK患者的黑点更集中在线性周围(图1)。3.C)。

图3
图3

基因共表达网络拓扑结构分析。从PBMCs中提取RNA,用RT-qPCR定量。分别构建了活性TAK和非活性TAK的基因共表达网络。计算任意2个基因表达水平的Pearson相关系数,构建相关矩阵。一个P值小于0.05被认为是显著的。蓝色边表示只在活跃的TAK组和不活跃的TAK组中存在关联。粗体线表示皮尔逊系数较大的线性相关r比0.74和更小P值超过0.01。一个根据度变化值(度活跃的−程度不活跃的).B排除减少程度较低的基因,利用其他基因构建网络图谱。C基因之间的线性关系用粗体线表示B

通过基因共表达网络的拓扑结构、血清生物标志物和基因表达水平,比较三种评估疾病活动性的方法的诊断效果

我们对三种评估方法进行了测试,并比较了诊断效果,每个患者的评估细节列于表中2.当使用基因共表达网络的拓扑结构评估疾病活动性时,敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为90.9%、100%、100%和90%(表2)2,无花果。4A).建立每种方法的roc,并计算auc(图1)。4B, C),采用拓扑结构的方法AUC最大(图。4D)。

图4
图4

分别利用基因共表达网络的拓扑结构、血清生物标志物和基因表达水平评估TAK患者的疾病活动性。一个评估采用由拓扑结构建立的评分体系。总分阈值为8分。B中华民国的一个C各指标的ROC。D各指标的AUC。ROC:受试者工作特征曲线。AUC,曲线下面积

讨论

TAK是一种慢性、复发、进行性血管炎,因此在长期随访中监测疾病进展非常重要。在本研究中,我们提出了一种利用分子诊断技术评估TAK疾病活性的新算法,该算法比血清生物标志物(包括ESR、CRP、IL-6和TNF-α)更直接、更敏感、更准确地反映T细胞激活。

ESR、CRP、IL-6、TNF-α是临床上评价TAK疾病活动性的常用指标,但它们的敏感性均较低,可能导致部分活动性TAK患者漏诊[13.].以CRP为例。多数情况下,TAK表现为慢性炎症而非急性炎症,这可能导致外周血中急性期蛋白水平正常。而TAK有时主要表现为局部血管炎症,因此很难在外周血中找到与疾病严重程度相关的高敏感性炎症生物标志物。此外,免疫抑制疗法可抑制CRP水平的升高[212223,这掩盖了炎症活动。因此,急性炎症标志物可能不是评估TAK疾病活动性的最佳指标,敏感性往往低于80%可能是不可避免的[23.1011

T细胞参与TAK的全身和血管表现[242526].外周血中T辅助细胞1(Th1)和Th17细胞数量的增加与TAK疾病活动性相关,活动性TAK患者比非活动性TAK患者有更多的IFN-γ-、IL-6-和il - 17a生产T细胞[24].TAK患者血管炎症浸润中存在IFN-γ-、IL-6-、il - 17a生成T细胞和T滤泡辅助细胞[2427].在活跃期,动脉病变中有一部分自反应T细胞来自于外周血,因此理论上可以在外周血中检测到T细胞的活化,这可能比急性期蛋白更加敏感。

本研究采用基因共表达网络拓扑结构、血液生物标志物和基因表达mRNA水平三种不同的方法评估疾病活性,并比较三种方法的诊断效果。结果表明,拓扑结构和基因表达mRNA水平的诊断效果优于生物标志物。值得注意的是,不仅有一个拓扑指标可以用来评估疾病活动性,而且我们发现toll样受体相关基因组是不活跃的TAK患者的指标,而不是活跃的,这表明该算法可以用来量化某一信号通路是否被激活,以及某一免疫反应是否发生在单个患者而不是患者组。基因共表达网络的拓扑结构反映了个体患者信号通路的激活,这可能揭示更多的机制,并有助于自身免疫性疾病的疾病分型。然而,本研究计算的方程在应用于临床之前可能需要用大样本进行校正。

此外,我们的研究在mRNA水平上提供了几个关于TAK疾病活性的新发现。首先,达克GATA3基因的表达增加病人活动性疾病的缓解和健康对照组相比,暗示一个持续的Th2反应在达克的活跃阶段,随着GATA3 Th2细胞特定的转录因子,它扮演了一个关键的角色在Th1、Th2子集之间的平衡免疫反应通过促进Th2反应而抑制Th1分化在T细胞分化的早期阶段(2829].关于Th2细胞在TAK疾病活性中的作用的研究相对较少。Gao等和Kong等人发现TAK患者外周血中Th2细胞百分比较健康对照组增加[30.31].有研究表明,由Th2细胞分泌、促进Th2细胞分化、抑制Th1细胞的IL-4在TAK患者PBMCs中的mRNA表达量明显高于健康对照组,且TAK患者受刺激PBMCs中IL-4的mRNA基因表达量高于对照组[30.3233].此外,Th2反应促进体液免疫和抗体产生[34].TAK患者常出现抗内皮细胞抗体,可能在发病机制中发挥作用[35].然而,一般认为TAK的炎症主要是由T细胞驱动的[36].虽然B细胞在TAK发病机制中的作用尚不明确,但越来越多的证据表明,B细胞和滤泡辅助T细胞(Tfh)发挥了重要作用,包括B细胞稳态紊乱,外周血、第三淋巴样器官、B细胞和动脉炎症区域特异性Tfh信号增多[373839].此外,我们发现,与健康对照组相比,积极治疗的TAK患者的GATA3水平较高,而非积极治疗的TAK患者的GATA3水平较低,这可能解释了TAK患者外周血中Th2水平是否升高的结果不一致的原因。也就是说,一些研究发现Th2水平升高,但另一些研究没有,这可能与没有根据疾病活动对TAK患者进行分组有关[30.3139].我们的研究结果在mRNA水平上提供了Th2细胞和体液免疫参与TAK发病机制的新证据。

我们的研究还显示,与不活跃的TAK患者相比,活跃的TAK患者中TCR、CD28、RORC和FOXP3的mRNA水平升高,这表明T细胞和Th17细胞参与了炎症活动,这与之前的研究结果一致[2440].有趣的是,与不活跃的TAK患者或健康对照组相比,活跃的TAK患者的T-bet mRNA水平没有显著增加。尽管一些研究发现活动性TAK患者外周血中Th1细胞水平高于非活动性TAK患者[40],一些研究没有检测到Th1细胞水平的升高[30.39],因此活动性TAK患者外周血中Th1细胞水平是否高于非活动性TAK患者存在争议。此外,与健康对照组相比,TAK缓解期患者TCR、CD28、RORC和FOXP3 mRNA水平降低,表现出减弱能力和T细胞数量的减少,我们推测这与免疫抑制治疗有关。

其次,我们发现,在比较活性TAK患者与非活性TAK患者时,虽然TCR、CD28、GATA3、RORC和FOXP3 mRNA水平升高,提示T细胞参与了TAK的疾病活性,但许多免疫检查点的mRNA水平没有升高,如CTLA4、PD-1、LAG3、TIGIT和TIM3。我们推测这可能与TAK患者PBMCs中IL-10分泌减弱有关[32414243].值得注意的是,尽管这些免疫检查点在活跃期没有增加,但新出现的基因共表达揭示了这些免疫检查点在TAK活跃期的激活,这表明基因共表达网络可能比TAK中的基因表达水平更准确地反映T细胞的激活情况。

本研究也有一定的局限性。一个重要的限制是缺乏新的TAK患者验证队列来确认结果。其次,TAK-naïve名患者未被纳入分析。免疫抑制和生物治疗可能抑制T细胞和改变线性模型的参数。最后,样本量相对较小。然而,样本间的轻微异质性和明显的统计上显著的组间差异表明结果的可靠性。下一步,我们计划在一个独立的大型随机队列中验证我们的模型,该队列包括四组TAK患者,如inactive-naïve TAK患者,active-naïve TAK患者,非积极治疗的TAK患者和积极治疗的TAK患者。

结论

外周血T细胞活性可能比某些急性炎症标志物更敏感地反映TAK的疾病活性,TAK患者基因共表达网络的拓扑结构有潜力应用于临床评估TAK的疾病活性。

数据和材料的可用性

资料可根据合理要求向通讯作者提供。

缩写

德:

Takayasu指出的动脉炎

PBMC:

外周血单个核细胞

Th:

辅助T细胞

RT-qPCR:

实时荧光定量聚合酶链反应

HC:

健康的控制

中华民国:

接收机工作特性曲线

AUC:

曲线下面积

ESR:

红细胞沉降率

c反应蛋白:

c反应蛋白

il - 6:

白细胞介素- 6

肿瘤坏死因子-α:

肿瘤坏死因子α

p65:

RELA原癌基因NFκB亚基

PDCD1:

程序性细胞死亡1,也被称为PD-1

PD-L2:

程序性细胞死亡1配体2

CTLA4:

细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4

TIM3:

T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3,也称为HAVCR2,甲型肝炎病毒细胞受体2

LAG3:

淋巴细胞激活3

TIGIT:

带有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体

识别:

T细胞受体

T-bet:

T-box在T细胞中表达,又称TBX21, T-box转录因子21

GATA3:

GATA-binding蛋白3

RORC:

rar相关孤儿受体C

BCL6:

BCL6转录抑制因子

具体:

P3 Forkhead框

SDHA:

琥珀酸脱氢酶复合黄蛋白亚基A

B2M:

Beta-2-microglobulin

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确认

不适用。

资金

本研究由国家自然科学基金资助J.L.(批准号:81401333)。

作者信息

作者和联系

作者

贡献

Y.T.进行了实验并分析了数据。J.L.和Y.T.设计了这项研究并撰写了论文。T.X和Z.X评估了数据并修改了论文。作者们阅读并批准了最终稿。

相应的作者

对应到李经新平田

道德声明

伦理批准和同意参与

该研究获得了中国北京协和医院机构审查委员会(S-478)的批准。所有参与者都获得了书面知情同意,研究按照《赫尔辛基宣言》进行。

同意出版

所有患者已批准稿件并同意出版。

相互竞争的利益

作者声明没有经济或非经济利益的竞争。

额外的信息

出版商的注意

卡塔尔世界杯常规比赛时间施普林格自然对出版的地图和机构附属的管辖权要求保持中立。

补充信息

补充文件1:补充表1。

用于实时荧光定量聚合酶链反应的引物。

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田,杨,李,俊,田,X。et al。利用T细胞激活相关基因共表达网络评估大动脉炎患者的疾病活性。关节炎Res其他23303(2021)。https://doi.org/10.1186/s13075-021-02636-2

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  • DOIhttps://doi.org/10.1186/s13075-021-02636-2

关键字

  • Takayasu指出的动脉炎
  • 诊断
  • T细胞激活
  • 疾病活动
  • 信使核糖核酸