蛋白多糖-4是滑膜巨噬细胞极化和炎性巨噬细胞关节浸润的重要调节因子

摘要

背景

滑膜巨噬细胞具有多种功能，包括清除细胞碎片和异物、组织免疫监视和消除炎症。巨噬细胞的功能多样性是由表达独特表面标记的不同亚群实现的。蛋白多糖-4 (PRG4)是滑膜增生和纤维重塑的重要调节因子，而巨噬细胞参与PRG4在滑膜中的作用尚不明确。我们的目的是研究PRG4在滑膜中巨噬细胞稳态调节和急性滑膜炎中促炎巨噬细胞浸润中的重要性，并研究巨噬细胞是否介导滑膜纤维化Prg4基因诱捕(Prg4^{GT / GT})小鼠膝关节。

方法

巨噬细胞表型出现在Prg4^{GT / GT}而且Prg4^+/+使用泛巨噬细胞标记(如CD11b、F4/80)和M1巨噬细胞(CD86)和M2巨噬细胞(CD206)的表面标记进行流式细胞术检测。在2个月和6个月大的动物中对各种巨噬细胞亚群进行了表征。研究了CD86+和/或CD206+巨噬细胞中炎症标志物IL-6和iNOS的表达。的影响Prg4检测了2个月和6个月大的动物滑膜巨噬细胞群的重组和促炎巨噬细胞对TLR2激动剂挑战的反应。使用氯丙酸脂质体和滑膜厚度清除巨噬细胞，并使用免疫组化方法评估纤维化标志物α-SMA、PLOD2和I型胶原(COL-I)的表达。

结果

总巨噬细胞Prg4^{GT / GT}关节高于Prg4^+/+关节(p < 0.00012和6月龄时，CD86+/CD206−和CD86+/CD206+巨噬细胞百分比增加Prg4^{GT/ GT}6个月的关节(p < 0.0001)，而CD86−/CD206+巨噬细胞的百分比下降(p < 0.001)．CD86+/CD206−和CD86+/CD206+巨噬细胞较CD86−/CD206+巨噬细胞表达iNOS和IL-6 (p < 0.0001)．Prg4重新表达限制了CD86+巨噬细胞的积累(p < 0.05CD86−/CD206+巨噬细胞增多(p < 0.001)。Prg42月龄动物滑膜增炎巨噬细胞重组减毒(p < 0.001)．氯膦酸钠介导的巨噬细胞减少滑膜增生、α-SMA、PLOD2和COL-I的表达(p < 0.0001)．

结论

PRG4调节滑膜巨噬细胞的积累和平衡。如果滑膜中没有M1，滑膜就会充满M1巨噬细胞。此外，巨噬细胞在滑膜纤维化中发挥作用Prg4^{GT / GT}动物．

滑膜是一种软组织，由表层、内膜和下内膜组成[1，2］．滑膜内膜有1 - 3细胞层厚，有两种细胞类型:成纤维细胞样滑膜细胞和巨噬细胞[1，2］．内膜下细胞较少，I型胶原蛋白含量显著，微血管血和淋巴管[2］．滑膜巨噬细胞由不同的异质细胞群亚群组成，具有多种功能，包括清除细胞碎片和异物、组织免疫监视和消除炎症[3.，4，5］．滑膜微环境调节巨噬细胞的异质性，因为它控制巨噬细胞在促炎和抗炎功能光谱上的极化[6，7，8，9］．在谱的一端是M1巨噬细胞表型，通过产生高水平的白细胞介素-1β (IL-1β)、肿瘤坏死因子α (TNF-α)、IL-6、小鼠巨噬细胞中特异性的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达和活性氧的产生介导促炎作用[10，11，12］．另一端是M2巨噬细胞表型，其特征是产生抗炎细胞因子;IL-10、白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1Ra)和转化生长因子β (TGF-β) [9，10，13］．M1巨噬细胞与滑膜炎症的加剧有关，与OA和RA的相关关节破坏有关[12，14]，而M2巨噬细胞在滑膜中的数量与关节炎症的缓解有关[15］．

蛋白多糖-4 (PRG4)是一种粘液糖蛋白，由成纤维细胞样滑膜细胞和浅带软骨细胞分泌[16，17］．PRG4作为相对软骨表面之间的边界润滑剂，可防止线粒体失调和浅表区软骨细胞凋亡[18］．生物学上，PRG4与许多受体结合，包括CD44和toll样受体2和4 (TLR2和TLR4) [19，20.，21］．PRG4-CD44相互作用抑制人滑膜成纤维细胞中核因子κB (NF-κB)核易位，减弱il -1β诱导的滑膜细胞增殖和基质降解酶的表达[22］．PRG4调节滑膜成纤维细胞向肌成纤维细胞的转变，减少纤维化标志物的表达：平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和I型胶原蛋白[23，24］．PRG4还抑制OA滑液抽吸液中DAMPs对TLR2和TLR4受体的激活[21］．滑膜增生和纤维化，随着年龄的发展，明显的小鼠膝关节缺损Prg4表达式[23，25，26］．PRG4的生物学作用有助于解释其在啮齿动物和猪创伤后骨关节炎(pto)模型中的疾病修饰活性，其中PRG4减少软骨退变并增强其修复[27，28］．虽然PRG4对滑膜成纤维细胞的作用已经被表征，但它在M1-M2谱上对滑膜巨噬细胞极化的贡献仍然很大程度上未知。初步证据表明，PRG4可能影响巨噬细胞的反应性，如腹膜巨噬细胞Prg4与腹膜巨噬细胞相比，TLR刺激后敲除小鼠分泌更高水平的IL-1βPrg4表达小鼠(29］．

滑膜炎是膝关节骨性关节炎患者的一个重要和常见的发现，是骨性关节炎放射学进展的一个独立预测因子[30.］．滑膜炎的特征是滑膜增生、内膜下纤维化和新生血管[31］．巨噬细胞和T细胞是在OA滑膜中遇到的主要免疫细胞，滑膜炎中产生的大多数炎症细胞因子都归因于激活的滑膜巨噬细胞[31］．滑膜纤维化是对慢性滑膜炎的一种不适应解决反应，其特征是交联I型胶原沉积增加，这是由于胶原生成增强和plod2介导的交联，以及滑膜成纤维细胞向激活的肌成纤维细胞的转变，其特征是α-SMA的新生表达[23，24］．滑膜纤维化的病因是免疫介导的，有假说认为，DAMPs触发tlr介导的滑膜巨噬细胞激活和随后TGF-β的释放，进而驱动滑膜的纤维化重建[32］．

在本研究中，我们旨在探讨PRG4在滑膜组织中调节巨噬细胞表型极化和积累的作用，以及在急性滑膜炎反应中促炎巨噬细胞的募集，并评估慢性滑膜炎和滑膜纤维化是否Prg4缺失关节由促炎性巨噬细胞表型的增强极化介导。在我们的研究过程中，我们使用差异和重叠标记研究了孤立滑膜组织中的滑膜驻留巨噬细胞(SRMs)和总巨噬细胞。我们还研究了促炎巨噬细胞的招募，这些巨噬细胞来自循环单核细胞，对TLR2激动剂的关节内挑战作出反应。我们假设PRG4维持滑膜巨噬细胞的稳态，在缺乏PRG4的情况下，巨噬细胞转向M1促炎表型，导致慢性滑膜炎和纤维化重塑。

动物和研究概述

的Prg4基因诱捕(Prg4^GT)鼠标(股票编号。025740, JAX, USA)天生缺乏Prg4可通过cre介导的重组恢复的表达[26］．的Prg^{GT / GT}动物表现出明显的滑膜增生和内膜下纤维化，重组似乎减弱了这些变化[23］．在这项研究中,Prg4复合(Prg4^{GTR GTR /}3周龄动物腹腔注射他莫西芬(0.1mg/g, 100μL玉米油)，连续10天，以基因诱捕动物为对照。我们也用过Prg4^+/+动物(股票# 101045,JAX;B6/129S背景)。在动物2或6月龄时进行研究，在动物4月龄时进行巨噬细胞消耗，我们将随机分配的幼崽和年龄匹配的雄性和雌性纳入我们的实验组。每组的动物数量是基于我们之前对Prg4以α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)染色为主要终点的滑膜纤维化重组[23］．我们的研究得到了查普曼大学IACUC委员会的批准。所有实验都按照既定的指导方针和规定进行。

我们研究了2个月和6个月大的srmPrg4^{GT / GT}而且Prg4^+/+膝盖关节。我们使用cd68 -一种组织内巨噬细胞标记物- cd11b和F4/80来鉴定SRMs [5，14］．srm被鉴定为CD68+ CD11b+ F4/80+ MHC class II−。我们还研究了CX3CR1受体在小鼠SRMs中的表达Prg4^{GT / GT}而且Prg4^+/+如CX3CR1+ SRMs的关节最近被证明发挥抗炎内稳态作用[5］．滑膜中的巨噬细胞总数被鉴定为CD11b+ F4/80+ MHC II类细胞和CD86+/CD206−、CD86+/CD206+或CD86−/CD206+的组合。在描述这些巨噬细胞时，我们使用了CD86 (M1标记)[33和CD206 (M2标记)[34，让我们了解在不同的实验条件下M1和M2表型之间的平衡。我们通过iNOS和IL-6染色证实了CD86+巨噬细胞的促炎表型，通过Arg-1染色证实了M2巨噬细胞的抗炎表型[35］．我们还研究了Prg4CD86+和CD206+巨噬细胞之间的平衡。为了进一步描述PRG4在调节促炎巨噬细胞招募中的作用，我们在小鼠中诱导滑膜炎Prg4^{GT / GT}而且Prg4^{GTR GTR /}使用Pam3CSK4 (Invivogen, USA)， TLR2激动剂[36］．基于MHC II类和Ly-6C阳性的CD11b+ F4/80+ MHC II类+ Ly-6C+ CD86+，我们确定了新浸润的促炎巨噬细胞[14，37］．我们也消耗了巨噬细胞Prg4^{GT / GT}使用关节内(IA)氯膦酸酯脂质体和CD11b免疫探针在这些动物滑膜组织中证实巨噬细胞消耗。我们选择了一个中间终点，氯膦酸钠治疗开始后的第15天，来评估滑膜组织中CD86+和/或CD206+巨噬细胞的变化。利用免疫组化技术，我们还研究了巨噬细胞在第30天减少对滑膜增生和纤维化的影响Prg4^{GT / GT}关节。最后，我们用小鼠M2a BMDMs的体外研究补充了我们的体内研究。我们研究M2a巨噬细胞的基本原理是基于当前的理解，即在没有炎症刺激的情况下，M2巨噬细胞是滑膜中的主要细胞群。我们使用已建立的分化方案生成M2a BMDMs，并测试rhPRG4治疗是否调节TLR2激动剂刺激的M2a BMDMs中细胞因子和趋化因子的分泌。鉴于M2a亚型在化解炎症和促进伤口愈合方面的作用，我们将研究重点放在M2a亚型上[9，10］．我们在体内研究的实验方法概述见补充图1．

各种巨噬细胞群体的免疫表型

分离关节囊组织，从两个膝关节收集成独立样本，用胶原酶- d (2mg/mL) (Sigma Aldrich, USA) + 1μL无rnase - DNase I (1U/μL) (ThermoFisher Scientific, USA)在Hanks平衡盐溶液(1mL)中消化1h, 37^oC.用40 μm尼龙网(Sigma Aldrich)过滤细胞悬浮液，以3000转/分的速度将细胞压成球5分钟。用活性染料(僵尸紫;BioLegend, USA)和荧光标记抗体如下所述。使用精密计数珠(BioLegend)估计感兴趣的巨噬细胞数量。我们的面板是使用BD地平线引导面板解决方案工具设计的，标记物染色的阳性阈值是使用荧光减1 (FMO)面板控件确定的。荧光结合抗体包括Alexa Fluor 488-anti-iNOS和PE-anti-Arg-1 (ThermoFisher Scientific)， APC-Cy7-anti-CD11b, FITC-anti-Ly-6C, PE-Cy7 - cd86和PerCP-Cy5.5 -i -a /I-E (MHC类II) (BD Biosciences, USA)， pe - cd68, Brilliant Violet 510-anti-F4/80, Alexa Fluor 488-anti-CX3CR1, pe - il -6和APC-anti-CD206 (BioLegend)，并在推荐稀释剂中使用。细胞在FACS阻断缓冲液(0.5% BSA + 2% FBS in PBS)中冰上悬浮10分钟，然后与抗体混合物在FACS染色缓冲液(0.5% BSA + 0.05%叠氮化钠in PBS)中冰上孵育20分钟。表面标记染色后进行Arg-1、CD68、IL-6和iNOS蛋白的细胞内染色。细胞悬浮在含有4.2%甲醛的BD Cytofix/ cytooperm缓冲液中，根据制造商的建议稀释氟铬偶联抗体，并在冰上孵育20分钟。随后，细胞用FACS洗涤缓冲液洗涤两次，然后进行流式细胞分析(BD FACSAria)。使用Flow Jo®软件(BD Biosciences)生成流式细胞术图和分析。 We performed two technical replicates for each independent biological sample, and the analysis output was the average of the two technical replicates.

M2a BMDMs的生成

2月龄大的股骨和胫骨骨髓Prg4^{GT / GT}而且Prg4^+/+分离动物，并按所述生成BMDMs [36，38］．第7天，IL-4 + IL-13诱导M2a BMDMs(两种细胞因子均为20 ng/mL;研发系统)24小时[38］．

Prg4对分泌细胞因子和趋化因子的靶基因表达及分析^{GT / GT}TLR2刺激后BMDMs±rhPRG4

2个月大的M2a BMDMsPrg4^{GT / GT}而且Prg4^+/+关节(每孔50万个细胞)用Pam3CSK4 (300ng/mL)处理或作为未处理对照组在无血清DMEM/F12培养基中培养24h，然后按照所述进行RNA分离、cDNA合成和定量PCR [36］．感兴趣基因的周期阈值(Ct)值Nos2；iNOS基因符号，il - 1β，il - 6，il - 10,TGF -β)归一化为的Ct值GAPDH在同一样本中，相对表达式用2^——ΔΔCt方法(39］．使用了以下引物和探针:Nos2(Mm00440502_m1),il - 1β(Mm00434228_m1),il - 6(Mm00446190_m1),il - 10(Mm01288386_m1),TGF -β(Mm01178820_m1),GAPDH(Mm99999915_g1)(所有可从ThermoFisher Scientific)。M2a BMDMs从Prg4^{GT / GT}Pam3CSK4±rhPRG4 [40] (200μg/mL)，持续24小时，然后使用蛋白质组分析小鼠细胞因子阵列试剂盒(Panel A, R&D Systems)进行基因表达研究和分泌细胞因子和趋化因子分析。用Image J®对蛋白点的信号强度进行量化，归一化为参考点的信号强度。数据表示为三个独立实验的综合像素密度的平均值±标准差。

Pam3CSK4、vehicle、rhPRG4或PBS的IA管理

2月龄小鼠在吸入异氟醚气体麻醉(5%诱导和2-3%维持)下膝关节注射IA。小鼠皮肤被刮除，并用局部消毒剂清洗。在放大镜下注射IA，经髌腱共注入10μL。比较了IA Pam3CSK4 (3μg / 10 μL)与对照(无菌水;10μL)Prg4^{GT / GT}而且Prg4^{GTR GTR /}动物。IA rhPRG4(1毫克/毫升;10μL)或磷酸盐缓冲生理盐水(PBS) (10μL)注射Prg4^{GT / GT}在24h对CD11b+ F4/80+ MHC class II−CD86+ iNOS+和CD11b+ F4/80+ MHC class II−CD86+ IL-6+巨噬细胞进行如上分析。

氯膦酸酯脂质体消耗巨噬细胞及其对Prg4滑膜纤维化的影响^{GT / GT}膝关节

Prg4^{GT / GT}关节注射氯膦酸酯脂质体(10μL;18.4 mM)或PBS脂质体(10μL) (Encapsula Nanosciences, USA)，每周两次，持续2周，在治疗开始后的第15天，我们量化CD11b+ F4/80+ MHC II类−CD86+或CD86−/CD206+巨噬细胞的百分比和上述CD86+巨噬细胞的数量。如上所述进行IA氯膦酸盐或PBS脂质体注射。在一项平行研究中，Prg4^{GT / GT}关节用氯膦酸盐或如上所述的PBS脂质体处理，并在治疗开始后的第30天收集关节，且年龄匹配Prg4^+/+以关节(4个月)为对照。关节脱钙，石蜡包埋，切片。切片用苏木精和伊红(H&E)染色，用每个标本五次厚度测量的平均值测定滑膜厚度。或者，用0.1% triton x100渗透切片10分钟，然后用染色缓冲液阻断切片20分钟。切片与兔抗α-SMA多克隆抗体(Abcam, USA)，前胶原-lysine-2- oxygulate -5-双加氧酶2 (PLOD2) (Abcam)， I型胶原(COL-I) (Abcam)和CD11b (Novus, USA)(所有抗体1:100稀释)孵育一夜^oC. PBS冲洗后，切片与cy3 -山羊抗兔IgG以1:200稀释在室温下孵育1h，用共聚焦显微镜(Olympus BX 51)成像。定义不同动物滑膜感兴趣区域，并将OD (Lum*μm²)的值计算并在组间进行比较。

统计分析

如我们先前所述，进行了统计分析[23］．我们用了未配对的，成对的学生的t单或双向方差分析，其次是Tukey的事后检验，统计显著性设为p < 0.05．具体的测试类型在图图例中说明。

Prg4中巨噬细胞的组织驻留部分减少^{GT / GT}滑膜组织消化释放的巨噬细胞和滑膜组织消化释放的巨噬细胞表现出年龄依赖性向CD86+促炎表型的转变，体内rhPRG4治疗减少了这一特定巨噬细胞群体中炎症标志物的表达。

srm的研究根据附录图中的方案进行1A，对该巨噬细胞群进行门控，如图所示2和无花果。1．另外，滑膜组织中巨噬细胞总数的研究按照补充图中的方案进行1，根据附图中的门控策略进行识别2和无花果。1 b．2个月和6个月大的巨噬细胞中被鉴定为srm的总百分比Prg4^{GT / GT}关节低于年龄匹配Prg4^+/+关节(p < 0.001；p < 0.0001；无花果。1 c)．此外,6个月大Prg4^{GT / GT}与2个月大的儿童相比，关节的srm比例较低Prg4^{GT / GT}关节(p < 0.001；无花果。1 c),而Prg4^+/+关节的SRM百分比没有随着动物年龄的增长而发生显著变化(p > 0.05)．典型的流式细胞术图显示CX3CR1+ SRMsPrg4^+/+而且Prg4^{GT / GT}图示动物。1 d．srm中CX3CR1+分数下降Prg4^{GT / GT}动物随着年龄的增长。而2月龄内CX3CR1+ srm的百分比Prg4^{GT / GT}与同龄动物相比，动物的发病率更高Prg4^+/+动物(p < 0.05；无花果。1 e)， 6个月时CX3CR1+ SRM百分比Prg4^{GT / GT}关节没有显著差异Prg4^+/+关节，但低于2个月Prg4^{GT / GT}关节(p < 0.01)．2月龄和6月龄关节巨噬细胞总数较高Prg4^{GT / GT}动物相比Prg4^+/+动物(p < 0.0001；无花果。1 f)．滑膜组织中的巨噬细胞由CD86和/或CD206蛋白表达模式不同的异质亚群组成。CD86+/CD206−和CD86+/CD206+巨噬细胞在2月龄和6月龄较高Prg4^{GT / GT}关节相比,Prg4^+/+动物(所有比较P <0.05；无花果。1克)，而CD86−/CD206+巨噬细胞在6个月时被耗尽Prg4^{GT / GT}关节(p < 0.001；无花果。1克)．M1/M2比值随年龄增长而增加Prg4^{GT / GT}动物相比Prg4^+/+动物(图。1 h)．M1/M2比值在6个月时较高Prg4^{GT / GT}与2个月大的Synovia相比Prg4^+/+和6个月大Prg4^+/+滑液(p < 0.001；p < 0.0001；无花果。1 h)．这些发现支持Prg4^{GT / GT}随着动物年龄的增长，巨噬细胞的总数增加，而组织内巨噬细胞的比例减少，这种变化与向更高的M1/M2比值转变有关。

CD86+和/或CD206+巨噬细胞2个月大Prg4^{GT / GT}根据关节iNOS和IL-6的表达情况进一步进行分类(图5)。2)．CD86+/CD206−和CD86+/CD206+巨噬细胞中IL-6+/iNOS+细胞的比例高于CD86−/CD206+巨噬细胞，其增加幅度约为4.5倍(p < 0.0001；无花果。2 b)．同样，CD86+/CD206−和CD86+/CD206+巨噬细胞中IL-6和iNOS的平均染色强度高于CD86−/CD206+巨噬细胞中相应的平均染色强度(p < 0.05；无花果。2摄氏度)．我们进一步研究了CD206+巨噬细胞，以确定它们是否共同表达经典的M2标志物，如Arg-1。我们在2个月大的时候观察到Prg4^{GT / GT}在动物中，CD206+巨噬细胞(约90%)中Arg-1也呈阳性(图1)。二维)．Arg-1+/CD206+巨噬细胞没有明显表达iNOS，大约88%的巨噬细胞为iNOS−(图。二维)．相比之下，IL-6+/CD86+巨噬细胞也是iNOS+ (p < 0.0001；无花果。2 e和F)．IA rhPRG4治疗对CD86+促炎巨噬细胞影响的研究按照补充图中的方案进行1C.在24小时，rhPRG4治疗减少了2个月大的IL-6+和iNOS+ CD86+巨噬细胞Prg4^{GT / GT}关节(p < 0.05对于比较;无花果。2 g和H)．相反，PBS没有改变CD86+巨噬细胞中IL-6或iNOS的表达(p > 0.05；无花果。2 g和H)．

Prg4重组限制了Prg4中巨噬细胞的积累^{GT / GT}在滑膜中有CD86−/CD206+ (M2)巨噬细胞，并减少促炎巨噬细胞的招募响应TLR2刺激。

的Prg4根据补充图中的方案进行重组研究1B.对CD86+和/或CD206+巨噬细胞进行门控，如补充图所示2和无花果。1 b．Prg4重组降低了2和6月龄动物滑膜组织中的巨噬细胞总数(p < 0.0001对于比较;无花果。3)．此外,Prg4与年龄匹配的非重组动物相比，重组降低了CD86+/CD206−和CD86+/CD206+巨噬细胞的比例(p < 0.05对于比较;无花果。3 b)．Prg4与非重组动物相比，重组也增加了CD86−/CD206+巨噬细胞的比例(p < 0.001；无花果。3 b)．CD86+和/或CD206+巨噬细胞的调控作用Prg4重新表达导致6月龄滑膜M1/M2比值降低Prg4^{GTR GTR /}与年龄匹配的动物比较Prg4^{GT / GT}动物(p < 0.01；无花果。3 c)．

如图所示，鉴别由循环单核细胞(以阳性MHC II类和Ly-6C表达为特征)产生的浸润性促炎症巨噬细胞的门控策略。3 d．与现有的巨噬细胞池相比，该巨噬细胞群具有M1促炎症表型，表现为更高的CD86表达Prg4^{GT / GT}关节(图。3 e)．TLR2刺激诱导了更多的促炎性巨噬细胞的招募Prg4^{GT / GT}关节相比,Prg4^{GTR GTR /}关节(p < 0.001；无花果。3 f)．此外，TLR2刺激导致CD86+/CD206−巨噬细胞增加，CD86−/CD206+巨噬细胞减少Prg4^{GT / GT}关节相比,Prg4^{GTR GTR /}关节(p < 0.0001；p < 0.05；无花果。3 g)．

来自Prg4的tlr2刺激M2a BMDMs^{GT / GT}动物炎症细胞因子表达升高，rhPRG4治疗减少了这些BMDMs分泌的细胞因子和趋化因子。

M2a BMDMs从Prg4^{GT / GT}TLR2刺激后，动物IL-1β和IL-6表达水平较高，IL-10表达水平较低。p < 0.05所有的比较;无花果。4)．而TLR2刺激可诱导BMDMs中iNOS的表达Prg4^{GT / GT}与野生型相比，两种基因型间iNOS表达水平无差异(p > 0.05；无花果。4)．rhPRG4治疗降低TLR2激动剂诱导的iNOS、IL-1β和IL-6的表达(p < 0.05对IL-10的表达没有影响Prg4^{GT / GT}M2a BMDMs(无花果。4 b)．Pam3CSK4±rhprg4处理的BMDMs的代表性蛋白组分析印迹显示，选择的细胞因子和趋化因子信号强度降低，如图所示。4摄氏度．蛋白质组分析器细胞因子阵列图见补充图3.．rhPRG4治疗可降低炎性细胞因子IL-6 (p < 0.0001)和TNF-α (p < 0.0001)和趋化因子:CXCL1/GRO-α (p < 0.001), CXCL2 / MIP-2 (p < 0.0001), CXCL10 (p < 0.001), CCL2 / MCP-1 (p < 0.001), CCL3 / MIP -α(p < 0.0001)、亚兰/ MIP -β(p < 0.0001)和CCL5/RANTES (p < 0.0001)(图。4 d)．

Prg4中巨噬细胞的减少逆转了滑膜纤维化^{GT / GT}膝关节

巨噬细胞损耗的研究按照补充图中的方案进行1D.如补充图所示对感兴趣的巨噬细胞群进行门控2和无花果。1 b．在我们的中间终点研究中(在治疗开始后第15天进行)，我们观察到氯膦酸盐脂质体治疗改变了滑膜组织中CD86+和/或CD206+巨噬细胞的分布，使CD86+和/或CD206+组分减少，并减少了CD11b+ F4/80+ MHC II类细胞事件的数量(图1)。5)，与滑膜巨噬细胞的消耗作用一致。氯膦酸酯脂质体治疗的结果是，与PBS脂质体治疗相比，CD86+和CD86−/CD206+巨噬细胞的百分比降低(p < 0.0001对于比较;无花果。5 b)．如上所示，随着动物年龄的增长，CD86+巨噬细胞在滑膜中大量繁殖，因此，它们可能与滑膜增生和纤维化的进展有关。因此，我们研究了氯膦酸钠对小鼠CD86+巨噬细胞数量的影响Prg4^{GT / GT}并检测到约62%的震级减小(p < 0.01；无花果。5度)．在我们的组织学终点研究中(在治疗开始后第30天进行)，我们观察到更明显的巨噬细胞耗损，表现为在h&e染色切片中免疫细胞减少，在氯膦酸盐治疗的滑膜组织中CD11b染色减少Prg4^{GT / GT}关节(p < 0.0001；无花果。5 d & F)．滑膜厚度也减少(p < 0.0001)氯膦酸酯脂质体(图。5 e)．此外，氯丙酸脂质体处理的滑膜组织中未检测到明显的α-SMA、PLOD2或COL-I染色Prg4^{GT / GT}在PBS脂质体处理的滑膜组织中检测到这些标记物Prg4^{GT / GT}关节(p < 0.001；p < 0.0001；p < 0.01；无花果。5 d & F)．

在这项研究中，我们研究了缺失关节滑膜组织中组织常驻和总巨噬细胞的时间变化Prg4表达，发现巨噬细胞的组织驻留部分随着年龄的增加而减少，同时巨噬细胞总数增加，表明非驻留起源的巨噬细胞已逐步入侵和聚集Prg4零滑膜组织。在Prg4在空白滑膜中，巨噬细胞的总数表现出年龄依赖性向促炎M1表型和远离抗炎M2表型的转变，因此，在6个月大的时候观察到M1/M2比值显著高Prg4滑膜坏死与明显的滑膜病理相吻合。在滑膜病理发展的早期，滑膜内的巨噬细胞似乎在抗炎CX3CR1+ SRM亚型中富集，可能是为了补偿滑膜中M1巨噬细胞的出现Prg4^{GT / GT}滑液。然而，随着年龄的增长和滑膜炎的持续，CX3CR1+亚群减少，表明滑膜巨噬细胞内源性抗炎作用减弱。发现了CD86和CD206均阳性的巨噬细胞群Prg4^{GT / GT}随着年龄的增长，巨噬细胞的数量增加，进一步支持了在体内，巨噬细胞可以以高度的可塑性存在，其中M1和M2标记物都由同一细胞表达。对于这种特定的巨噬细胞亚型，尚不清楚它是主要的促炎症作用还是抗炎症作用。为了研究这一点，我们探索了其他功能M1标记物，如IL-6和iNOS，并得出结论，CD86+/CD206+巨噬细胞具有促炎表型，通过增强IL-6和iNOS表达来指示，这与CD86+巨噬细胞相当。因此，我们有理由认为，这种巨噬细胞群与CD86+/CD206−巨噬细胞一起在介导慢性滑膜炎中发挥效应作用Prg4零关节。CD86+/CD206+巨噬细胞可能起源于滑膜中的CD86−/CD206+对应体。我们观察到在TLR2受体激动剂处理后Prg重组关节中CD86−/CD206+巨噬细胞的减少伴随着CD86+/CD206+巨噬细胞的相应增加，这表明M2巨噬细胞在TLR2刺激下表达CD86。这一现象在人类巨噬细胞中已有报道，其中M2巨噬细胞在TLR2刺激下显示M1标记[41]，这些巨噬细胞也具有促炎症表型[41］．TLR2信号参与了CD86+/CD206+巨噬细胞的生成，这也得到了TLR2激活是小鼠巨噬细胞中CD86上调和随后体外和体内Th1免疫反应的必要条件的支持[42］．

Prg4重组重新建立滑膜巨噬细胞稳态，使滑膜中富含抗炎的M2巨噬细胞，并阻止M1巨噬细胞在滑膜中的积累，从而使M1/M2比值与年龄匹配的野生型组织中的相应比值一致。关节缺乏外源性PRG4给药Prg4PRG4的表达立即减弱了促炎M1巨噬细胞表型，因为它减少了CD86+巨噬细胞中iNOS和IL-6的表达，表明PRG4对巨噬细胞有直接作用。为了进一步探索这一假设，我们对PRG4是否可以直接调节巨噬细胞对炎症刺激的反应性进行了体外研究，以补充我们的体内研究。我们检测到M2巨噬细胞的抗炎活性受损Prg4空白动物表现为IL-10减少，IL-1β和IL-6表达增加。此外，rhPRG4通过tlr2刺激的M2a BMDMs减少炎症因子的表达和分泌。因此，我们的体外实验支持PRG4调节巨噬细胞激活，其在关节体内的稳态作用可能是通过直接作用于滑膜巨噬细胞而促进的。然而，PRG4对滑膜成纤维细胞的生物学作用是在减弱滑膜病理特征的背景下Prg4Null小鼠也应该被考虑。PRG4对滑膜成纤维细胞有直接的抗炎、抗增殖和抗纤维化作用[22，23]，因此，滑膜成纤维细胞的调节是PRG4在滑膜内的稳态作用的潜在机制组成部分。PRG4在关节中也有润滑的机械作用，这种作用的缺失可能有助于观察到滑膜巨噬细胞稳态失调Prg4零的老鼠。尽管如此，PRG4对体内巨噬细胞的作用可能具有生物学意义，特别是在抑制炎症和相关滑膜增生和纤维化方面。我们对巨噬细胞损耗的研究支持了巨噬细胞在调节滑膜病理中的重要作用Prg4零的老鼠。滑膜巨噬细胞的减少可以减少滑膜增生和纤维化，这与PRG4缺失时巨噬细胞极化的异常模式是介导慢性滑膜炎的假说一致Prg4零关节。

我们对巨噬细胞在滑膜纤维化中的作用的认识非常有限。在其他组织中，不同的巨噬细胞群似乎协调炎症的起始、维持和化解及其相关的组织修复[43］．组织内巨噬细胞维持组织免疫稳态[3.，4]，炎症的成功解决需要将促炎巨噬细胞转换为抗炎表型和激活组织内巨噬细胞池以帮助组织修复之间的协调[4，44］．在我们的Prg4^{GT / GT}模型中，炎症没有得到充分的解决，这是由消炎组织的巨噬细胞数量减少和M1巨噬细胞向M2巨噬细胞缺乏分化造成的。慢性炎症的不充分解决Prg4关节缺失导致组织修复失调，因此随着年龄的增长滑膜纤维化的发展[23］．由于滑膜中大量的巨噬细胞是促炎细胞，我们旨在评估这些促炎巨噬细胞的减少是否会改变滑膜增生和纤维化的轨迹。我们利用氯膦酸脂质体来消耗滑膜中的巨噬细胞，因为脂质体促进了嗜水氯膦酸酯在吞噬性巨噬细胞中的内化，氯膦酸酯导致了巨噬细胞的凋亡[45］．氯膦酸酯脂质体已成功用于清除滑膜巨噬细胞，在给药后7天，巨噬细胞可出现耗竭[45，46］．氯膦酸酯脂质体用于在小鼠手术诱导的实验性OA模型中清除巨噬细胞[46，47］．在一份报告中，单剂量氯膦酸酯脂质体减少滑膜衬巨噬细胞，减少mmp -3介导的软骨退变[46]，而在另一项研究中，超过9周的3次剂量方案减少了滑膜整个厚度的巨噬细胞，降低了滑膜炎评分和滑膜厚度[47］．在我们的模型中，我们使用了超过2周的4剂量方案，并评估了巨噬细胞池的早期变化Prg4^{GT / GT}滑液。氯膦酸钠治疗可减少滑膜中促炎和抗炎巨噬细胞的比例。在我们进行组织学分析时，巨噬细胞从滑膜组织的整个厚度被耗尽，同时纤维化标记物的表达被抑制，滑膜增生减少。由于氯膦酸钠治疗会导致巨噬细胞的全部消耗，因此很难将其对纤维化的解决作用归因于特定巨噬细胞群的消耗。尽管如此，有人认为，由于在给药时滑膜中主要的巨噬细胞表型是促炎的，由于对滑膜中的促炎巨噬细胞有显著的消耗作用，氯膦酸钠可能通过抑制滑膜炎症发挥其作用。我们的研究结果共同强调关节缺乏滑膜增生和纤维化Prg4表达可能通过向促炎性巨噬细胞的增强转移和重建巨噬细胞表型稳态来传播Prg4复合(23]或通过消耗滑膜巨噬细胞对减轻滑膜病理是有效的。

循环单核细胞在滑膜中募集并分化为促炎巨噬细胞，增加现有的M1巨噬细胞池，加剧滑膜炎[12］．在我们的学习中，缺乏Prg4滑膜中的表达增强单核细胞的招募和分化为促炎性巨噬细胞Prg4重组限制了浸润的巨噬细胞在关节内的积累。促炎巨噬细胞在滑膜中增殖的大小，与Prg4这可能解释了PRG4如何调节单核细胞来源的促炎巨噬细胞的招募。滑膜内有较大的M1炎性池，见Prg4在TLR2刺激下，null小鼠可能在关节中产生更多的趋化因子，从而增加单核细胞的招募。虽然我们还没有具体测量在Prg我们的目的是研究PRG4是否调节体外BMDMs的趋化因子分泌。我们观察到BMDMs分泌CXC和CC家族的趋化因子[48]到不同程度。CXC趋化因子吸引中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞到滑膜[48]，而CC趋化因子则吸引单核细胞、T细胞和自然杀伤细胞[48］．rhPRG4以生物学上显著的幅度减少了多种趋化因子的分泌，对CCL4的影响最大。总的来说，与CXCL1和CXCL2相比，rhPRG4治疗的CCL2、CCL3、CCL4和CCL5的趋化因子降低幅度似乎更大。rhPRG4能够减弱激活巨噬细胞的趋化因子分泌，这可能为我们观察到单核细胞浸润减少提供了一个合理的解释Prg4重组。

显然，M1-M2巨噬细胞极化的二分性不足以充分描述滑膜中巨噬细胞的多面和复杂功能[49］．然而，根据广义的M1-M2分类来研究巨噬细胞表型平衡的变化仍然是有用的，特别是如果它们可以与组织水平上的结构和病理变化相关的话。我们选择了M1和M2巨噬细胞的两个标记物，用于研究OA患者和临床前手术诱导的OA模型滑膜组织中的巨噬细胞表型平衡[49］．我们还使用了补充标记，如IL-6和iNOS来确认感兴趣的巨噬细胞群的促炎表型。在2个月大的动物中，大多数CD206+巨噬细胞缺乏CD86的表达，Arg-1也被用作CD206+巨噬细胞M2表型的确认标记。我们在基因陷阱动物中观察到的随着年龄增长的巨噬细胞表型平衡的变化趋势与在小鼠DMM模型中报道的相似，在DMM手术后6周滑膜中M1巨噬细胞(F4/80+ CD86+ CD63−)增加[50]， M2巨噬细胞(F4/80+ CD11c+ CD206+)在DMM术后8周减少，iNOS+巨噬细胞增加[51］．这些DMM滑膜巨噬细胞的研究与我们目前的研究结果相结合，为研究PRG4在调节OA滑膜巨噬细胞极化中的作用提供了强大的动力，作为其疾病修饰活性的基础[27，28］．我们的研究有许多局限性。一个局限性是我们没有研究巨噬细胞损耗对软骨健康的影响Prg4^{GT / GT}关节。此外，我们没有研究关节损伤的影响，如DMM对滑膜巨噬细胞极化的影响Prg4无效和有能力的小鼠。我们的工作重点是分析滑膜中的巨噬细胞，并面临技术挑战，我们没有描述其他关节腔室中的巨噬细胞，如滑膜液。关节液巨噬细胞可能在滑膜病理中起作用Prg4^{GT / GT}动物。然而，滑膜中的巨噬细胞由于其物理位置接近，对滑膜增生和纤维化的影响最大。在本研究中，我们无法以足够高的产量筛选出M1/M2 (CD86+ CD206+)混合巨噬细胞群体，从而对M1 (CD86+ CD206−)和M2 (CD86−CD206+)巨噬细胞进行广泛的表型比较表征。最后，我们没有比较IL-6和iNOS在M1巨噬细胞中的表达程度Prg4^{GT / GT}从野生型动物的M1巨噬细胞在创伤性关节损伤后。

综上所述，我们已经证明PRG4在维持滑膜巨噬细胞稳态方面起着重要作用Prg4滑膜中巨噬细胞总数增加，表现为促炎巨噬细胞增多，抗炎巨噬细胞减少。当促炎巨噬细胞充斥滑膜时，滑膜增生和纤维化等结构变化变得显著，巨噬细胞的减少逆转了滑膜病理。鉴于在OA患者和临床前OA模型中已经报道了促炎和抗炎滑膜巨噬细胞之间的不平衡，以巨噬细胞极化为目标，通过滑膜PRG4的上调直接或间接重建稳态的新治疗方法可能有助于治疗慢性滑膜炎，从而减缓OA的进展。

不适用

• 2021年10月29日

  本文的更正已发表:https://doi.org/10.1186/s13075-021-02640-6

αsma:

平滑肌动蛋白

方差分析:

方差分析

CD44:

集群行列式44

COL-1:

胶原蛋白1型

Ct:

循环阈值

CX3CR1:

C-X3-C基序趋化因子受体

抑制:

有关分子模式

DMEM:

杜尔贝科改良的鹰培养基

数字:

内侧半月板不稳定

ELISA:

酶联免疫吸附试验

GAPDH:

Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶

IL-1β:

Interleukin-1β

IL-1Ra:

Interleukin-1受体拮抗剂

il - 6:

白细胞介素- 6

il - 10:

白细胞介素- 10”

伊诺:

诱导型一氧化氮合酶

MCP-1:

单核细胞化学引诱物蛋白1

MHC II级:

主要组织相容性复合体II类

基质金属蛋白酶:

基质金属蛋白酶

NF -κB:

核因子kappa b

办公自动化:

骨关节炎

PBS:

磷酸盐

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

PLOD2:

2-氧葡萄糖酸5-双加氧酶2

PRG4:

Proteoglycan-4

美国专利商标局:

创伤后关节炎

类风湿性关节炎:

类风湿性关节炎

rhPRG4:

重组体人PRG4

srm:

Synovium-resident巨噬细胞

SM:

滑膜巨噬细胞

TLR2:

toll样受体2

TLR4:

toll样受体4

转化生长因子-β1:

转化生长因子β 1

不适用

KE和GJ得到了R01AR067748的支持。

作者和联系

1. 吉赞大学药学院药理学系，沙特阿拉伯王国，吉赞，82826

   Marwa卡

2. 美国罗德岛州普罗维登斯罗得岛医院急诊部

   葛瑞戈里·杰、张玲

3. 美国康涅狄格州法明顿市康涅狄格大学牙科医学院生物医学工程系

   丹宁酸a。施密特

4. 查普曼大学药学院生物医学和药学科学系，瑞克健康科学校区，美国加利福尼亚州欧文市Jeronimo路9401号，92618

   Jennifer Totonchy & Khaled A. Elsaid

贡献

MQ和KE构思了这项研究。MQ、LZ、GJ、JT和KE进行了实验，并参与了数据分析。TS提供了试剂和结果的关键解释。作者参与了手稿的起草和批判性评价。作者们已经阅读并批准了手稿的最终版本。

作者的信息

Pharm.D Marwa卡。，Ph.D.: Assistant Professor of Pharmacology, Jazan University School of Pharmacy, Jazan, Kingdom of Saudi Arabia.

Gregory D. Jay，医学博士:教授，紧急医学和工程，布朗大学，普罗维登斯，罗德岛，美国。

张玲，医学博士:美国罗德岛医院高级研究助理。

Holly Richendrfer:研究员，罗德岛医院，普罗维登斯，罗德岛，美国。

Tannin A. Schmidt，博士:美国康涅狄格州法明顿市康涅狄格大学健康中心生物医学工程副教授。

Jennifer Totonchy，博士:美国查普曼大学生物医学和药学科学助理教授。

哈立德·埃尔赛德，药剂师。D，Ph.D.: Associate Professor of Biomedical and Pharmaceutical Sciences, Chapman University, Irvine, CA, USA.

相应的作者

对应到哈立德·a·Elsaid．

伦理批准和同意参与

小鼠关节囊组织的提取，关节内给药Pam3CSK4，脂质体氯膦酸盐和PBS，小鼠关节的组织学评价和小鼠骨髓的提取得到了查普曼大学IACUC委员会的批准。所有实验都按照既定的指导方针和规定进行。

同意出版

不适用

相互竞争的利益

MQ、LZ和JT没有什么要公开的。

GJ撰写了rhPRG4的专利，并持有美国马州卢博思有限责任公司的股权。

ATS撰写了rhPRG4的专利，是美国马州润滑有限责任公司的付费顾问，并持有美国马州润滑有限责任公司的股权。

KE撰写了rhPRG4的专利。

作者与此稿件没有任何非经济利益的竞争关系。

出版商的注意

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