黏膜部位抗肽酰精氨酸脱亚胺酶-4抗体可激活类风湿关节炎中肽酰精氨酸脱亚胺酶-4酶活性

背景

黏膜部位被假设在类风湿关节炎(RA)的发展中起作用。由于血清抗肽精氨酸脱亚胺酶(PAD)4抗体，包括与PAD3交叉反应的一个亚群(PAD3/4)，是RA的特异性抗体，与严重疾病相关，我们试图检查抗pad4和抗PAD3/4抗体是否存在于RA患者和RA“高危”受试者的肺和口腔黏膜中。

方法

基于家族性RA和/或血清抗瓜氨酸化蛋白抗体(ACPA)阳性，我们纳入37例RA、25例健康对照和46例RA“高危”受试者。配对血清、痰液和唾液用免疫沉淀法检测抗pad4和抗pad3 /4，用ELISA法检测ACPA。从代表性样品中纯化免疫球蛋白(Ig)，用抗cith3免疫印迹法检测其对重组人PAD4组蛋白H3瓜氨酸化的影响。

结果

抗pad4抗体分别在6/37(16.2%)、3/37(8.1%)、3/33 (9.1%)RA受试者的血清和1/46(2.2%)高危受试者的血清和痰中检测到。健康对照组的任何部位都没有抗pad4抗体。在RA持续时间为>年的RA受试者中，血清、痰和唾液抗pad4抗体更普遍。从具有代表性的抗PAD4阳性和抗pad3 /4阳性痰液中纯化的抗体主要为IgA同型，能够提高PAD4酶活性。

结论

抗pad4抗体存在于部分RA患者的痰液和唾液中，在高危人群中很少出现。重要的是，痰中抗PAD4抗体，特别是抗pad3 /4抗体增强PAD4酶活性的能力表明，抗PAD4可能在RA肺中发挥积极作用。

类风湿性关节炎(RA)是一种以疾病特异性自身抗体为特征的全身性自身免疫性疾病，其标志之一是抗瓜氨酸化蛋白抗体(acpa)。瓜氨酸化蛋白是通过钙依赖性肽酰精氨酸脱亚胺酶(PAD)酶对精氨酸残基的脱亚胺产生的。人体内有五种PAD同工酶(PAD1, PAD2, PAD3, PAD4和PAD6) [1]，其中PAD2和PAD4与RA的发病机制密切相关。在23-45%的慢性RA患者和17-22%的早期RA患者(<2年)的血液中发现了PAD4自身抗体[2，3.，4，5，6，7，8］．抗pad4抗体也与ACPA和更严重的关节疾病相关，提示在发病机制中起作用。抗pad4抗体子集与相关酶PAD3发生交叉反应(称为抗PAD3/4抗体)，并与最严重的关节损伤和间质性肺疾病(ILD)的影像学证据有关[3.］．抗pad3 /4抗体具有在生理钙浓度下显著提高PAD4酶活性的独特能力，这可以导致蛋白质瓜氨酸化的增加。

在风湿性关节炎发生前的临床前阶段，18%的受试者血清中也发现了抗pad4抗体[9］．资料显示，风湿性关节炎临床前阶段的炎症和抗体产生最初可能发生在粘膜部位，如肺和口腔粘膜[10，11，12］．这些数据包括我们之前的研究结果，即acpa会在已确诊RA的受试者的痰中产生，以及在未来有发展为RA的“风险”的无RA受试者的痰中产生[13，14］．粘膜受累也与关节疾病发作后风湿性关节炎的发病机制有关[15，16］．我们先前的研究发现，血清抗pad3 /4抗体与已确定的风湿性关节炎的肺部疾病影像学证据相关[3.表明这些抗体可能存在于肺中并活跃。然而，它们在包括肺在内的粘膜部位的存在还没有得到评估。因此，我们试图探索抗PAD4和抗pad3 /4抗体在RA患者的痰和唾液中的存在，以及RA的风险受试者，并确定它们对PAD4酶活性的影响。

研究对象

受试者从RA肺研究的病因学研究中招募，该研究在其他地方有详细描述[13，14］．简单地说，这项肺研究旨在研究在RA发展的不同阶段肺自身免疫的生物标志物。在这项横断面研究中，储存的样本包括风湿性关节炎受试者(N= 37)和健康对照组(N= 25)。基于抗环瓜氨酸肽(CCP) ELISA检测，RA受试者均为血清acpa阳性(QUANTA Lite CCP3.1 IgG/IgA或CCP3 IgG, Inova Diagnostics, San Diego, CA, USA)，并根据1987年RA分类标准和2010年RA分类标准进行了病历回顾，以确认RA诊断，或之前由委员会认证的风湿病专家诊断为抗CCP+ RA。健康对照组没有RA的个人或家族病史，血清抗ccp阴性。我们还纳入了46名有一级亲属患风湿性关节炎的风险受试者(N= 20)，经社区或临床筛查发现血清抗ccp阳性(N= 15)，或两者兼有(N= 11)。在样本收集时，高危受试者没有炎症性关节炎的临床或历史证据。

研究访问

所有受试者都采集了血样和痰液。大多数患者(79%)在收集痰液之前也采集了唾液。使用标准化问卷获取人口统计信息和自我报告的吸烟和慢性肺病史。

HLA-DRB1测试

对从每个患者全血中分离的DNA进行免疫遗传学分析，以确定其存在HLA-DRB1使用前面描述的方法包含共享表位的等位基因[17］．

痰和唾液的收集和处理

使用吸入性高渗盐水收集诱导痰，并建立之前已描述的方案[13，14］．部分受试者(33名RA, 21名对照组，31名高危患者)在痰诱导前提供未刺激的唾液样本。抗pad4抗体测试后残留的唾液样本也进行了ACPA测试，其中包括28名RA、19名对照组和28名高危受试者(见下面抗体测试方法的描述)。所有样品均保存在−80°C。

血清、痰液、唾液ACPA检测

配对血清、痰和唾液采用抗ccp3.1 (IgG/IgA, Inova Diagnostics, San Diego, CA, USA) ELISA检测ACPA。在血清中，使用制造商建立的抗ccp3.1阳性截止水平。对于痰液，在一个单独的健康对照组(N = 100，中位年龄37岁，71%女性，22%曾经吸烟)中，痰液抗ccp3.1阳性的临界值设置为痰液抗ccp3.1水平的第95个百分位。对于唾液，在一个单独的健康对照组(N = 80，中位年龄48岁，60%女性，24%曾经吸烟)中，唾液抗ccp3.1阳性的临界值设置为唾液抗ccp3.1水平的第95个百分位。

血清、痰、唾液抗pad检测

采用已建立的两层定量免疫沉淀法检测抗pad4和抗pad3 /4抗体[2］．简单地说，受试者血清(1 μl)、痰液(10 μl)或唾液(20 μl)与1 μl³⁵年代-蛋氨酸标记的PAD4或通过体外转录和翻译(Promega)生成的PAD3在4℃下1小时。用40 μl Protein A小球免疫沉淀并洗涤，用2×十二烷基硫酸钠缓冲液洗脱结合抗原。免疫沉淀蛋白用凝胶电泳分离，射线显像，密度法定量。对密度测定值进行背景校正，并归一化到一个已知的阳性参考血清进行并行分析。基于已知阴性样本的分析，标准化值>0.140抗pad任意单位被认为是抗pad4或抗pad3抗体阳性。对两种pad反应性均为阴性的样品被视为“抗pad阴性”;根据我们之前的工作，那些对PAD4反应阳性但对PAD3反应阴性的被认为是“抗PAD4单反应性”，那些对PAD4和PAD3反应性都阳性的被定义为“抗PAD3/4交叉反应性”，[2］．对所有使用抗iga、IgM或igg偶联琼脂糖珠(Sigma;cat#A3316, A2691和A9935)来定义存在的每个同型的抗pad4或抗pad3 /4抗体的比例。

PAD4活动测试

为了确定自身抗体对PAD4酶活性的影响，从抗PAD4阴性、抗PAD4单反应和抗pad3 /4交叉反应的血清和痰液中联合纯化IgG和IgA，使用等量的蛋白A/G琼脂糖混合物(Pierce;cat#20423)和肽M琼脂糖(InvivoGen;猫# gel-pdm-2)珠子。这种混合物主要纯化所有四种IgG亚类和IgA同型，对IgM的纯化最少。总Ig浓度采用NanoDrop (Thermo)法测定，>95%纯度采用考马斯锡染色法测定，成分采用山羊抗人IgG抗体和兔抗人IgA抗体免疫印迹法测定(Jackson Laboratories)。纯化的Ig对PAD4活性的影响使用重组人PAD4进行评估，如前所述，内部纯化[18］．PAD4 (10 nM)与1 μM纯化的Ig在4℃下预孵育45分钟，然后与700 μM组蛋白H3底物孵育3小时，在37℃下，增加氯化钙浓度(即0.2和2 mM)，如上所述[2］．用抗瓜氨酸化组蛋白H3免疫印迹法(ab5103, Abcam)评价组蛋白H3的瓜氨酸化。

统计分析

采用年龄Kruskal-Wallis检验和二分类变量卡方/Fisher确切检验(包括抗pad抗体阳性患病率)比较组间受试者特征。所有分析均使用SPSS软件(版本25)进行，数据使用GraphPad Prism版本8生成。

人口统计资料

受试者人口统计数据列于表中1．研究对象主要是女性和非西班牙裔白人。健康对照组的人更年轻，现在吸烟的可能性更小。RA受试者更有可能至少有一个HLA-DRB1共享抗原决定基等位基因。只有9/37(24%)的RA受试者患有慢性RA，定义为在2年前以上被诊断为RA。

血清、痰液和唾液抗pad4抗体的患病率

我们发现6/37 (16.2%)RA受试者血清中有抗pad4 IgG，这6名受试者中有2名(33.3%)血清中有PAD3/4抗体子集(图5)。1和表1)．此外，我们在3/37 (8.1%)RA受试者的痰液中检出抗pad4 IgG，其中1人(33.3%)痰液中检出抗pad3 /4抗体。在有唾液可用的受试者中，我们发现3/33 (9.1%)RA受试者唾液中有抗pad4 IgG，但无抗pad3 /4阳性。所有痰液或唾液抗pad4抗体的患者血清中抗pad4抗体也均呈阳性，2/3的患者痰液和唾液中均有抗pad4抗体。因此，1/37 (2.7%)RA受试者唾液中抗pad4抗体呈阳性，而唾液中抗pad4抗体呈阳性，1/37 (2.7%)RA受试者唾液中抗pad4抗体呈阳性。

我们还发现1/46(2.2%)高危受试者血清及伴随痰液中抗pad4和抗pad3 /4 IgG阳性。1和表1)．在任何高危受试者的唾液中均未检测到抗- pad4。虽然组间的统计比较没有基于只有一个阳性的危险受试者，血清和痰抗pad4阳性的危险受试者是一个65岁的女性，从不吸烟，没有慢性肺部疾病的历史，血清和痰抗ccp抗体，但没有唾液抗ccp抗体。在21个月后的随访研究中，该高危受试者未发生风湿性关节炎。重要的是，在测试的健康对照组的血清、痰或唾液中均未检测到抗pad4或抗pad3 /4抗体。

在已确诊的RA患者中，血清、痰液和唾液抗pad4 IgG与痰抗ccp阳性的相关性无显著趋势(表2)2)．血清抗pad3 /4抗体的RA受试者，包括痰抗pad3 /4阳性的受试者，痰抗ccp阳性。血清、痰液和唾液抗pad4 IgG与唾液抗ccp阳性之间无相关性(数据未显示)。血清抗- pad4阳性与慢性RA相关(表2)，痰液和唾液抗- pad4阳性与慢性RA之间的类似相关性无显著趋势。血清、痰液或唾液抗pad4阳性和抗pad4阴性RA受试者在年龄、性别、吸烟史、共同表位阳性或慢性肺部疾病史上无显著差异。值得注意的是，3名RA受试者报告有ILD病史，其中1/3(33%)在血清、痰和唾液中抗pad4抗体阳性。这名患者的血清中也有抗pad3 /4抗体子集，但痰液或唾液中没有。

血清、痰液和唾液抗PAD4抗体亚型及其对PAD4活性的影响

痰和唾液中抗pad4 IgG的发现促使我们确定在这些不同的解剖部位存在的抗pad4抗体的同型分布(图。2a, b).如预期的那样，血清中抗pad4和抗pad3 /4抗体主要为IgG同型。另一方面，大多数患者的痰液中富含IgA同型的抗pad4和抗pad3 /4交叉反应抗体。有趣的是，唾液中抗pad4抗体的主要同型为IgG, IgA为中等数量，IgM明显较少。

一些RA患者的血清抗PAD4 IgG已被证明可以调节PAD4的催化活性[3.，19]，有一部分患者具有增强PAD4对瓜氨酸底物能力的IgG。我们之前发现抗pad3 /4阳性患者的血清IgG是最激动的[2］．为了确定抗PAD4和抗pad3 /4抗体的激动活性是否因解剖部位而不同，我们从具有代表性的抗PAD4阴性、抗PAD4单反应和抗pad3 /4交叉反应RA或高危患者样本的成对血清和痰标本中共同纯化IgG和IgA，并在体外测试其调节PAD4活性的能力(图1)。2c, d).因为pad4激活抗体先前被证明可以减少催化所需的钙量[2]，测试了两种不同生理钙浓度(0.2和2.0mM)。尽管Ig总量趋于正常，但血清和痰中IgG和IgA的相对丰度在个体间有所不同。然而，无论Ig的解剖学来源(血清或痰)，抗pad3 /4 Ig(图。2c,车道9 - 12;和无花果。2d，通路7-10)，以及较小程度的抗pad4单特异性Ig(图。25 - 8 c,车道;无花果。2d, lane 11-12)，能够提高PAD4对瓜氨酸组蛋白H3的催化活性，高于抗pad阴性Ig和无Ig对照(图1)。2c,通道1 - 4;无花果。2d,车道1 - 6)。

我们在部分已确诊的RA患者的痰液和唾液中发现了抗pad4抗体，并对这些自身抗体的同型和功能能力进行了表征。与血清抗pad4抗体类似，痰液和唾液抗pad4抗体与较长的RA病程(>2年)相关，并显示出与肺抗ccp阳性相关的趋势。然而，与血清和唾液抗pad4抗体主要是IgG同型不同，痰抗pad4自身抗体主要是IgA。虽然在我们的队列中，痰和唾液抗pad4抗体的总体患病率较低，但与高危和对照受试者(98-100%特异性)相比，它们对RA具有高度特异性。此外，痰抗pad3 /4抗体(主要是IgA抗体)增强了PAD4的催化活性，这表明它们可以在RA患者的肺中直接放大PAD4活性。

我们目前的研究填补了已发表文献中的重要空白，并强调了黏膜位点在ACPA和抗pad4自身抗体反应发展中的时间性和作用方面可能存在的重要差异。数据支持ACPA可能起源于粘膜部位，并且在已建立的RA中，黏膜ACPA生成非常普遍。这些数据包括:在血清ACPA无阳性的高危人群的痰中存在ACPA，以及ACPA在确诊RA患者的痰和支气管肺泡灌洗液中高度普遍[13，14，20.］．相反，我们的研究显示，抗pad4抗体在高危受试者的血清和痰液中是罕见的，仅在已确诊的抗pad4血清阳性RA患者的痰液中观察到。此外，血清ACPA阳性在RA的临床前阶段很高，而我们目前的研究和发表的数据表明，血清抗pad4抗体在临床前阶段的频率要低得多，且与较长的RA疾病持续时间相关[4，9，21］．总的来说，这些数据表明，与ACPA相比，抗pad4抗体可能遵循不同的起源模式，而抗pad4抗体可能是RA进化过程中较晚发生的事件。

抗pad4抗体是疾病的放大器，而不是acpa阳性RA的病因，另一个证据是发现血清抗pad3 /4抗体与RA患者的疾病持续时间和严重关节疾病相关[2］．这些抗体具有增强PAD4酶活性的能力，这表明它们可能驱动炎症部位瓜氨酸化自身抗原的持续产生。我们在三名确诊的RA患者中发现了抗pad3 /4 IgA的痰液，提示这些抗体可能驱动肺中瓜氨酸化抗原的持续生成。需要在更大的队列中进行进一步的研究，以确定痰抗pad4和抗pad3 /4抗体的临床意义，以及它们是否可能在一组高危和RA个体的肺炎症放大中发挥直接作用。其中一部分必须是确定抗PAD4 IgG和IgA对肺中PAD4酶激活之外的效应功能的精确贡献，包括Fc受体参与和细胞效应。同样重要的是，在未来的痰液研究中，考虑针对相关酶PAD2的抗体的流行率和作用，因为血清抗PAD2抗体已在具有较轻关节和肺部疾病的RA患者的血清学和遗传学差异群体中发现[22］．

血清抗pad3 /4抗体与RA患者的ILD影像学证据有关[3.，即使没有症状。尽管我们的研究样本量小，但有趣的是，在三名痰中有抗pad4抗体的RA受试者中，只有一名既往临床诊断为ILD。此外，我们之前曾报道过血清抗pad4抗体与吸烟史无关[23］．这在目前的研究中得到了支持，在一些没有吸烟史的个体中发现血清、痰和唾液抗pad4抗体的产生。我们的研究并不是为了检测ra相关肺部疾病中的痰抗pad4抗体，但我们在本研究中证实了这些抗体可以存在于肺中，这为未来的研究提供了支持，这些研究可以专门解决痰抗pad4或抗pad3 /4抗体是否与ra相关肺部疾病的患病率、严重程度或未来发展有关。

我们的研究需要注意的是，与之前的报道相比，本队列RA患者血清抗pad4抗体阳性的患病率较低(分别为16.2% vs. 23-45%) [4，5，7］．在我们的研究中，anti-PAD4的低流行率很可能是由于RA患者中慢性RA的比例很低(24%)。在已发表的研究中，早期RA的血清抗pad4抗体患病率较低，而在我们的研究中，4/9(44%)慢性RA患者中存在血清抗pad4抗体。我们的研究中痰液和唾液抗pad4阳性的患病率也很低，这限制了我们识别RA患者的临床特征与痰液或唾液抗pad4抗体之间所有可能的联系的能力。在这项研究中，我们还发现了痰中抗pad4和抗ccp抗体的关联趋势。虽然我们无法确认这些痰抗体的瓜氨酸特异性，但我们发表的研究已经证明了RA患者痰中存在瓜氨酸特异性ACPA [24］．此外，高危队列的横断面性质限制了对这些患者抗pad4自身抗体演变的推断。在本研究中，我们也不能完全排除抗体从血清转位到肺或口腔粘膜的可能性。然而，考虑到血清中主要的抗pad4抗体同型是IgG，而痰中主要是IgA，这是不太可能的，这表明IgA在肺黏膜中局部产生。此外，无论来源(即来自血清的局部生成或易位)，我们证明了一些RA患者痰液中的抗PAD4抗体具有激活PAD4的能力，这表明它们可能有助于直接在肺中局部产生瓜氨酸化蛋白。重要的是，我们在粘膜部位发现的抗pad4和抗pad3 /4抗体的新发现，有力地支持了未来研究的必要性，以确定RA中与该抗体亚群相关的患病率和临床特征。

总之，我们在部分RA受试者和一名RA风险受试者中发现了痰抗pad4和抗pad3 /4抗体，在一组已确诊疾病的患者中发现了唾液抗pad4抗体。这些数据支持了长期以来的假设，即粘膜部位可能在RA的发病机制中发挥重要作用。

本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从相应作者处获得。

acpa:

Anti-citrullinated蛋白抗体

中国共产党:

循环citrullinated肽

ILD:

间质性肺病

搞笑:

免疫球蛋白

垫:

Peptidylarginine deiminase

类风湿性关节炎:

类风湿性关节炎

不适用

这项研究得到了Jerome L. Greene基金会、美国国立卫生研究院[资助号AR066712]、科罗拉多临床和转化科学奖UL1 TR001082-04、NIH U01 AI101981和Walter S. and Lucienne Driskill基金会的支持。内容是作者的唯一责任，并不一定代表NIH的官方观点。这些资金来源都没有涉及到研究的设计或数据的收集、分析或解释。

作者和联系

1. 美国科罗拉多州奥罗拉市邮站B-115号，1775奥罗拉院，科罗拉多大学安舒茨医学院风湿病科

   M. Kristen demuelle, Ashley Visser, Johnny wong, V. Michael Holers和Kevin D. Deane

2. 美国马里兰州巴尔的摩市5200 east ave套房5300约翰霍普金斯大学风湿病科，21224

   王宏，瑞安·l·戴维斯和艾丽卡·达拉

3. 美国科罗拉多州奥罗拉市科罗拉多公共卫生学院

   吉尔·m·诺里斯

贡献

MKD为研究设计、受试者队列开发和数据获取做出了贡献;监督ACPA测试;对数据进行分析和解释;并准备了手稿和数字。HW和RLD进行了抗pad4测试和相关实验。AV进行痰液处理和ACPA检测。JH协助数据分析和解释。JMN, VMH和KDD对受试者队列的发展和数据的获取做出了贡献。ED参与了研究设计和数据采集，监督了anti-PAD4相关实验，对数据进行了分析和解释，并准备了手稿和图表。所有作者阅读并批准了最终稿件。

相应的作者

对应到m·克里斯汀Demoruelle或Erika Darrah．

伦理批准和同意参与

所有的研究程序都得到了科罗拉多州多机构审查委员会的伦理批准(#13-2606)。所有受试者均获得书面知情同意。

同意出版

不适用

相互竞争的利益

ED是授权专利号的作者。8,975,033人，题为"与pad4交叉反应的pad3特异性人类自身抗体及其在类风湿性关节炎和相关疾病的诊断和治疗中的应用"。MKD、JMN、VMK、KDD和ED已获得辉瑞公司对RA相关研究的支持。ED获得了Bristol Myers Squibb和Celgene的研究支持，VMH和KDD获得了Janssen的RA相关研究支持。所有其他作者都声明他们没有竞争利益。

出版商的注意

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