初潮年龄，自然停经年龄，类风湿关节炎风险-孟德尔随机化研究

背景

激素生殖因素已被认为在类风湿关节炎(RA)的病因学中起着重要作用，这是一种主要影响女性的自身免疫性炎症疾病。我们进行了一项双样本孟德尔随机化(MR)研究，研究了初潮年龄(AAM)、自然绝经年龄(ANM)和第一胎年龄(AFB)三种相关暴露与RA风险的关系。

方法

我们收集了迄今为止在AAM (N= 329,345)， anm (N= 69,360)， afb (N= 251,151)、RA (N_情况下= 14361,N_控制= 43,923)，都是欧洲血统。我们构建了强大的工具，使用数百个与暴露相关的遗传变异，并通过不同的MR方法估计因果关系，包括反方差加权法、MR- egger回归法和加权中位数法。我们进行了多变量MR以控制多效效应，特别是通过肥胖和社会经济地位作用。我们还进行了重要的敏感性分析，以验证模型假设。

结果

我们没有发现任何证据支持基因预测生殖因素与RA (OR)风险之间的因果关系_{AAM中的每sd增量}= 1.06 (0.98 - -1.15);或_{ANM中的每sd增量}= 1.05[0.98-1.11]，或_{AFB的每sd增量}= 0.85[0.65 - -1.10])。去除回文snp (OR_{AAM中的每sd增量}= 1.06[0.97-1.15]，或_{ANM中的每sd增量}= 1.05[0.98-1.13]，或_{AFB的每sd增量}= 0.81[0.61-1.07])或排除与潜在混杂性状相关的snp (or_{AAM中的每sd增量}= 1.03[0.94-1.12]，或_{ANM中的每sd增量}= 1.04[0.95 - -1.14])。通过遗漏分析，未发现外围仪器。

结论

我们的MR研究不能令人信服地支持生殖因素对RA发展的偶然影响，如初潮年龄、绝经年龄和头胎年龄。尽管我们使用了大量增强的仪器，但这些仪器只能解释暴露的表型变异的一小部分。我们在这方面的知识仍然不足，未来应该设计更大样本量的研究来复制或质疑我们的发现。

类风湿性关节炎(RA)是一种慢性自身免疫性炎症疾病，主要影响育龄妇女，如果不及时治疗或控制不当，往往会导致致残和预期寿命缩短。风湿性关节炎流行率的性别差异已经有充分的证据证明，该疾病袭击女性的频率和严重程度更高。例如，据估计，50岁以下女性患风湿性关节炎的几率是男性的4-5倍，60-70岁年龄段是男性的2倍[1］．此外，观察性研究表明，一般来说，女性RA患者比男性患者更糟糕[2］．

女性比例过高的原因尚不清楚，但与x相关的遗传因素和激素成分可能与此有关。有些妇女在性激素变化的过渡时期患风湿性关节炎，例如在怀孕后和/或绝经前[3.］．调节激素水平的药物，包括长期口服避孕药[4和/或绝经后激素治疗[5已经被发现与风湿性关节炎风险的降低有关。这些观察强调了激素和生殖因素在疾病病因学中的作用。

几项大规模流行病学研究使用了三种最容易获得的测量方法——初潮年龄(AAM)、自然停经年龄(ANM)和第一胎年龄(AFB)，调查了女性生殖因素与风湿性关节炎之间的关系，但结果仍存在争议。例如，在1976年至2002年期间纳入121700名妇女的纵向护士健康研究发现，月经初潮≤10岁的年龄与血清RA阳性风险增加相关(RR 1.6, 95% CI 1.1-2.4)，但与整体RA风险无显著相关性[6］．这项研究(NHS, 1976-2010;NHSII 1989-2011)还揭示了自然绝经期的早期年龄(≤44岁)与血清阴性RA的风险增加相关(合并HR 2.4, 95% CI 1.5-4.0) [7］．来自瑞典EIRA研究的数据，是一项基于人群的女性偶发RA病例的病例对照研究(2035例病例和2911名对照，年龄18-70岁)，显示与未生育的女性相比，初生的年轻女性(< 23岁)患ACPA(瓜氨酸肽抗原抗体)阴性RA的风险增加(OR 2.5, 95% CI 1.5-4.1) [8］．一项使用第三次全国健康和营养检查调查1892名参与者的横断面数据进行的分析没有发现月经初潮年龄或怀孕史与绝经后风湿性关节炎之间的任何关联[9］．这些差异也许并不令人惊讶，因为传统的流行病学研究通常依赖于环境信息，结果很可能受到测量误差、混杂和反向因果关系的影响。

包括青春期和生育能力在内的激素生殖因素受到遗传、营养、社会经济和环境因素的影响，在妇女中可能存在高度异质性。然而，最近大规模全基因组关联研究(GWAS)利用数百万欧洲血统的女性发现了AAM、ANM和AFB的基因调控。这些结果为利用孟德尔随机化(MR)进行因果推断提供了宝贵的机会。这种方法使用遗传变异(单核苷酸多态性，SNPs)作为工具变量(IVs)，从观察数据中评估风险因素对结果的因果影响。由于snp在受孕时是随机分配的，而且总是在疾病发生之前，MR的结果不太容易混淆和反向因果关系，这是传统观察研究的主要局限性[10］．据我们所知，还没有进行磁共振分析来检查激素生殖因素和RA发展之间的潜在因果关系，其结果可能有助于解决患者对青春期、生育、母性和RA的关注，并提高我们对RA的生物学机制的认识。

因此，我们的目标是对具有RA风险的三种女性生殖因素(AAM、ANM和AFB)进行第一次也是最大的两样本MR。与每个生殖事件相关的遗传变异被用作工具变量(IVs)。从最近发表的和在AAM进行的最大GWAS中提取了iv暴露的相关性(N= 329,345)， anm (N= 69360)和AFB (N= 251151) [11，12，13］．从RA中进行的最大GWAS中提取iv预后相关性(N_{类风湿性关节炎}= 14361,N_控制= 43923) [14］．

我们采用标准的双样本框架进行了当前的研究，其中静脉注射暴露相关和静脉注射结果相关来自两组独立的不重叠个体。为了减少人口分层，我们只纳入了欧洲血统的个体。

曝光

三次生殖暴露被先前的GWAS(s)证明具有多基因成分。月经初潮是女性青春期发展的一个里程碑，其年龄在女性之间有显著差异。最近的一项meta-GWAS研究强调了AAM的基因调控，该研究纳入了由ReproGen联盟、23andMe和英国生物银行收集的329,345名女性，并确定了389个与AAM相关的独立信号，分布在10个生物通路上[11］．自然绝经年龄对不孕症和包括乳腺癌和心血管事件在内的疾病风险产生重大影响。最近对69360名女性的GWAS研究了ANM的遗传结构，发现位于44个基因组区域的54个独立信号，其中大多数被发现包含一个或多个DNA损伤反应途径基因[12］．生殖行为，如第一次生育的年龄，已知部分是由生物过程驱动的。最近的一项GWAS研究了251,151名女性中AFB定义的生殖速度的遗传结构，并确定了10个AFB相关位点[13］．

在所有三个GWAS中，独立信号(我们的IVs)定义如下:首先使用基于距离的度量定义索引变量列表，通过该度量，任何通过双尾显著性阈值的snp (P< 5 × 10⁻⁸)在另一个显著SNP的1 Mb内被认为位于同一位点。然后使用来自英国生物银行研究的LD参考面板，在GCTA中使用近似条件分析增强信号列表。只有不相关的次级信号(r²< 0.05)均纳入最终列表。所有iv在小等位基因频率> 0.001和Hardy-Weinberg平衡> 1 × 10条件下均通过质量控制程序⁻⁶．从每个GWAS中提取iv暴露相关因子[11，12，13］．

结果

iv -结局相关的meta-GWAS涉及18个参与队列，总计14,361例RA病例和43,923例欧洲血统对照。据我们所知，这18项研究的参与者中没有人与GWAS暴露的参与者重叠[14］．

统计分析

孟德尔随机化分析

我们应用了几种MR方法，包括逆方差加权方法[15]，一种基于极大似然的方法[16， MR-Egger回归[17]和加权中位数方法[18］．

简单地说，IVW代表了主要的传统方法，只有当分析中的所有遗传变异都是有效的工具变量时，它才给出一致的估计。当IVs较弱时，IVW倾向于低估估计的真实变化量，而似然法给出了适当的估计置信区间。MR-Egger评估了工具变量的定向多效性，其中的截距项可以解释为遗传变异的平均多效性的估计。加权中位数方法对异常值具有鲁棒性，即使在50%的遗传变异为无效iv时也能提供一致的估计;被认为对水平多效性相对更稳健。

敏感性分析

有效的MR分析由三个关键模型假设定义:IVs与感兴趣的风险因素(相关性)紧密相关，与结果没有共同原因(独立性)，并且仅通过暴露影响结果(排除限制)[10］．在满足所有三个假设的基础上，可以根据观察数据得出暴露和结果之间的因果推论。

我们进行了几个重要的敏感性分析来验证MR模型假设。对于每个索引SNP，我们在GWAS目录中寻找其与混杂性状的潜在关联，并排除多效性SNP进行分析。此外，我们使用了一种鲁棒调整轮廓评分(MR-RAPS)方法，该方法对系统多效性和特质多效性都具有鲁棒性，并在所有数值示例中表现出色[19］．受教育程度和肥胖是影响生殖性状和风湿性关节炎风险的两个重要混杂因素[20.］．我们进一步整合GWAS的汇总统计数据和教育和BMI的附加IVs，并进行基于ivw的多变量MR (MVMR)评估生殖因素对BMI和教育影响的直接影响[21，22］．最后，我们每次排除一个SNP，并对其余SNP进行IVW以识别外围的IVs。

我们使用Brion等人提出的检验统计量的非中心性参数来计算统计功率。http://cnsgenomics.com/shiny/mRnd/)．所有分析均使用R v3.6.3中的“TwoSampleMR”、“MRInstruments”和“Mendelian Randomization”软件包进行。

道德/同意声明

我们的研究是对现有的、去识别的、总结级GWAS数据的二次分析。在本研究中检查的每个GWAS的具体伦理和同意声明可以在GWAS的原始出版物中找到。

总的来说，我们没有找到令人信服的证据支持三种激素相关暴露与风湿性关节炎风险之间的因果关系。具体地说，基因预测AAM没有显著影响使用IVW方法(OR_{AAM中的每sd增量}[95% ci]， 1.06[0.98-1.15])。不同方法的估计保持一致_{AAM中的每sd增量}[95% CI]的最大似然1.07 [1.00-1.14]，MR-Egger回归1.11[0.90-1.36]，加权中位数1.08[0.97-1.21])。我们没有观察到明显的多效性迹象(PMR-Egger截距= 0.69)。同样，我们也没有发现任何令人信服的证据支持基因修饰的ANM与使用IVW (OR)的RA之间的偶然联系_{ANM中的每sd增量}[95% CI]， 1.05[0.98-1.11])或MR-Egger回归(or_{ANM中的每sd增量}[95% ci]， 1.04[0.90-1.20])。使用加权中位数方法(OR_{ANM中的每sd增量}[95% ci]， 1.03[0.98-1.08])。一致地，对于基因预测的AFB，我们没有观察到使用IVW (OR)与RA有任何显著的关联_{AFB的每sd增量}[95% CI]， 0.85 [0.65-1.10])， MR-Egger回归(OR_{AFB的每sd增量}[95% CI]， 3.32[0.36-30.81])，或加权中位数方法(or_{AFB的每sd增量}[95% ci]， 0.90[0.73-1.10])。事实上，对于ANM和AFB，使用最大似然方法都得到了显著的结果，但已知该方法通过忽略水平多效性而提供更好的功率，而且结果不被其他方法支持。我们没有观察到明显的水平多视征象(P对于MR-Egger截距，ANM = 0.92, AFB = 0.26)1)．

去除回文snp后，结果保持一致(AAM的OR [95% CI]， 1.06 [0.97-1.14];1.05[0.98-1.13]用于ANM;0.81 [0.61-1.07] AFB)。见补充表1而且2， AAM和ANM iv也被发现与潜在混杂物相关，而10个afb相关iv中没有一个被NHGRI-EBI目录(补充表)引用3.)．使用283个AAM相关iv和42个AAM相关iv排除多效SNPs，我们没有检测到AAM或ANM对RA风险的因果影响(or [95% CI]， AAM为1.03 [0.94-1.12]，ANM为1.04[0.95-1.14])，证实了我们的主要发现(表1)．

为了有效地控制多效性，我们接下来研究了鲁棒性调整剖面评分(RAPS)方法，该方法对系统性和特质性多效性都具有鲁棒性[19］．我们进行了MR-RAPS估计，发现结果与我们的主要发现基本一致(表2)．

教育和BMI是两个可改变的危险因素，两者在RA的病因学和生殖暴露中都起着重要作用。接下来，我们进行了基于ivw的MVMR，以估计生殖因素对风湿性关节炎的直接影响，包括肥胖和社会经济地位的混合效应。MVMR的结果与我们的初步发现一致。在调整BMI (OR [95% CI]， 0.97[0.83-1.13])或教育程度(OR [95% CI]， 1.07[0.98-1.16])后，AAM合并RA的效果没有显著改变。同样，对于ANM，在调整BMI (OR [95% CI]， 1.06[0.99-1.27])或教育程度(OR [95% CI]， 1.04[0.98-1.11])后，我们没有观察到RA有任何显著影响。对于AFB，在调整BMI (OR [95% CI]， 0.85[0.57-1.24])或受教育程度(OR [95% CI]， 1.10[0.58-2.11])后发现了类似的零效应(表3.)．

在一次迭代去除一个SNP并使用剩下的SNP进行IVW分析中，我们没有观察到明显的外围SNP，比值比与我们的主要发现一致，接近估计的期望值(图1)。1)．

最后，我们计算了我们分析的力量。如表所示4， RA GWAS样本量为58284例，占24.64%。根据3次暴露GWAS(s)， AAM的389个指标SNPs可解释7.4%的表型变异，ANM的54个指标SNPs可解释5.7%的表型变异，AFB的10个指标SNPs可解释0.2%的表型变异。在目前的情况下，对于AAM，我们的研究有80%的几率检测到10.4%(即ORs为1.104)RA风险增加的因果效应。对于ANM，最小可检测效果为12%的增加(即ORs为1.12)。对于AFB，最小可检测效果为70%的增加(即ORs为1.70)。我们在表中给出了一系列的功率估计4．

在这项研究中，我们检查了三种激素生殖性状(AAM、ANM和AFB)与主要影响女性的自身免疫性炎症性疾病RA之间的假定因果关系。我们利用了在欧洲血统人群中对这些性状进行的最大GWAS的汇总统计数据，并使用与暴露相关的数百个snp构建了强大的工具(f统计量为AAM 67.6, ANM 77.6, AFB 50.3)。通过单变量MR分析，我们没有找到令人信服的证据支持生殖因素对风湿性关节炎的因果影响。通过敏感性分析和多变量MR分析确定了一致的无关联，证明了我们的研究结果的稳健性。

目前，传统流行病学研究对这一主题的结果仍存在争议，但许多研究指向了正相关。例如，一项纳入121700名女护士的研究发现，月经初潮≤10岁与血清RA阳性风险增加相关(RR 1.60, 95% CI 1.10-2.40) [6］．1991年至1996年期间，一项包括30,447名受试者(18,326名妇女)的社区健康调查发现，绝经早期(≤45岁)与随后发生类风疮之间存在关联(OR 2.42, 95%可信区间1.32-4.45)，在调整吸烟、教育水平和母乳喂养时间(OR 1.92, 95%可信区间1.02-3.64)之后，这一关联仍然显著(OR 1.92, 95%可信区间1.02-3.64)[23］．一项31336名北美女性的前瞻性队列研究报告了类似的发现(RR_{绝经期>51 vs绝经期<45}0.64, 95%ci 0.41-1.00) [24］．

然而，我们的大规模MR并没有确定三种明确的激素暴露与风湿性关节炎风险之间的假定因果关系。造成这种差异的原因有几个。首先，生殖因素是由遗传和环境因素共同形成的高度复杂的异质性状，单靠遗传并不能完全捕获这些性状的表型变异。例如，头胎出生年龄是一种人类行为特征，主要受社会心理、文化和经济因素的影响，而不是遗传因素。其次，以往流行病学研究的结果很可能受到混杂因素的影响。例如，肥胖是影响暴露和结果的一个重要混杂因素。一项磁共振研究表明，初潮年龄延迟1年可使成人BMI降低0.38 kg/m²(95% CI 0.25-0.51 kg/m²) [25］．我们最近发表的MR [26］．传统的流行病学调查很可能没有充分控制肥胖的混杂效应。观察性研究报道了教育对风湿性关节炎的保护作用[27，28］．一项磁共振研究发现，月经初潮1年后，花在教育上的时间增加0.14年(53天)[29］．我们进行了MVMR以控制肥胖和教育的影响，阴性结果证实了我们在零关联上的主要发现。最后，也有可能是生殖因素对风湿性关节炎的真正因果影响是有限的，我们的研究还不足以确定这一点。

激素因素和RA发生的生物学机制尚不清楚。性激素对免疫系统的影响及其与环境和遗传因素的相互作用可能部分解释了在女性中观察到的风湿性关节炎的高发率。雌激素是免疫系统的一种复杂调节剂，具有刺激和抑制作用[30.］．例如，排卵至妊娠期水平的雌激素刺激B细胞和Th2反应，支持自反应T细胞和B细胞克隆的生存。另一方面，雌激素可以抑制细胞介导的反应，如Th17细胞的分化[30.，31，32］．与产后风险增加相比，孕期RA发病风险降低，这表明激素变化或暴露于胎儿父亲HLA在RA发病中的作用[33］．

我们的研究有几个优势。据我们所知，还没有进行MR来评估生殖因素和RA之间的关系。我们结合了三种不同的生殖特征(初潮年龄、自然停经年龄和初产年龄)，反映了生育期的长度，并且相互补充得很好。此外，我们进行了重要的敏感性分析，以验证MR模型假设。我们选择了由最大的GWAS确定的最显著的独立snp，因此所有snp都与兴趣暴露密切相关，确保了“相关性”假设。我们排除了暴露-结果关系中与潜在混杂因素相关的snp，以满足“排除限制”假设。通过不同方法观察到的一致结果进一步支持了我们的发现。

我们必须承认一些限制。首先，我们的分析使用了欧洲人口，这限制了其普遍性。其次，我们使用三种暴露(AAM, ANM和AFB)作为激素生殖特性的代理的遗传工具，只捕获了有限比例的表型变异。生殖因素是受遗传、环境、社会经济等不同因素及其相互作用影响的复杂性状。我们研究的设计使我们无法考虑环境影响。第三，我们将暴露作为一个连续变量来评估每个生殖事件的遗传预测年龄与RA风险之间的关联——我们仍然不能排除非线性效应，而我们的研究目前的数据还没有捕捉到这一影响。这方面的未来工作可能集中在生殖事件的年龄分类上。第四，我们的研究使用了全部RA(其中大多数为血清阳性RA， > 85%)，而没有指定以瓜氨酸肽或风湿病因子抗体存在/不存在为特征的疾病亚群。激素因素可能通过不同的方式影响不同的类风湿性关节炎亚群。此外，除了目前研究中考虑的两个干扰因素(肥胖和教育)外，激素使用和健康状况等其他因素也有可能扰乱了我们的研究结果。 However, it is difficult to control for the effect of hormone therapy due to limited availability of genetic data underlying this trait. Finally, power calculations showed that potential weak effects were difficult to be detected in our analysis.

总之，使用单变量和多变量孟德尔随机化方法，我们无法提供证据支持生殖因素对RA发展的偶然影响，如初潮年龄、绝经年龄或头胎年龄。考虑到相对薄弱的遗传工具和力量，我们的结果并不那么令人惊讶。这些发现代表了在确定女性激素生殖因素和女性疾病RA之间的因果关系方面迈出的初步但重要的一步。由于一些激素因素可能是可以改变的，了解它们的确切作用对于未来针对高危妇女的预防性干预至关重要。我们在这方面的知识仍然不足，未来的研究应该设计更大的样本量和更好的力量来增加我们在这一领域的知识。

本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。

类风湿性关节炎:

类风湿性关节炎

麦:

月经初潮年龄

ANM:

自然绝经年龄

空军基地:

头胎年龄

ACPA:

瓜氨酸肽抗原抗体

先生:

孟德尔随机化

GWAS:

全基因组关联研究

单核苷酸多态性:

单核苷酸多态性

四:

工具变量

IVW:

反变量加权方法

体重指数:

身体质量指数

MVMR:

多变量孟德尔随机化

Day FR等人、Day FR等人、Barban N等人、Yengo L等人、Lee JJ等人分别从GWAS中获得了AAM、ANM、AFB、BMI、教育和RA的遗传相关性的汇总统计数据，Okada Y等人进行了RA meta-GWAS。我们感谢所有研究人员分享全基因组总结统计数据。

这项研究没有从公共、商业或非营利部门的资助机构获得任何具体的资助。由卡罗林斯卡学院提供的开放获取基金。

作者和联系

1. 浙江中医药大学第一附属医院，杭州，中国

   晶晶朱

2. 浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院妇科，中国杭州

   郑妞妞

3. 卡罗林斯卡学院分子医学中心临床神经科学系，Tomtebodavägen 5, 17 177，瑞典斯德哥尔摩

   Lars Alfredsson &夏江

4. 分子医学中心，瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡学院

   Lars Klareskog和Leonid Padyukov

5. 美国波士顿哈佛大学陈曾熙公共卫生学院流行病学系遗传流行病学和统计遗传学项目

   夏江

6. 四川大学华西公共卫生学院华西第四医院，中国成都

   夏江

贡献

JJZ和XJ设计了研究，分析了数据，解释了结果，并撰写了手稿。ZN, LA, LK, LP对结果进行了解释和修改。所有作者都向通讯作者提供了在稿件中署名的许可。XJ是本研究的担保人。作者们阅读并批准了最终稿。

相应的作者

对应到夏江．

伦理批准和同意参与

本研究使用的汇总统计数据是数据的汇总水平，不包含任何个人信息。原GWAS已获得相关伦理审查委员会的伦理批准。

同意出版

不适用

相互竞争的利益

作者声明没有竞争利益。

出版商的注意

卡塔尔世界杯常规比赛时间施普林格自然对出版的地图和机构附属的管辖权要求保持中立。

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