跳到主要内容gydF4y2Ba

在系统性硬化症真皮成纤维细胞中,长链非编码RNA HOTAIR通过Notch信号诱导GLI2的表达gydF4y2Ba

摘要gydF4y2Ba

目标gydF4y2Ba

系统性硬化症(SSc)的特征是身体主要器官的组织纤维化,包括皮肤、肺和心脏。我们之前曾报道lncRNA HOTAIR在SSc肌成纤维细胞(纤维化的关键细胞成分)的激活中发挥核心作用。HOTAIR通过h3k27me3介导的Notch信号通路激活诱导成纤维细胞活化。在这里,我们的目的是确定Notch下游驱动SSc肌成纤维细胞激活的信号事件。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

3例近期发生SSc的成年患者前臂全层皮肤活检获得成纤维细胞。lncRNA HOTAIR通过慢病毒转导在健康皮肤成纤维细胞中表达。GANT61和GLI2 siRNA可以抑制Hedgehog信号通路。Gamma分泌酶抑制剂RO4929097和DAPT被用于阻断Notch信号通路。GSK126对Zeste 2增强子(EZH2)有抑制作用。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在真皮成纤维细胞中过表达HOTAIR可诱导Hedgehog途径转录因子GLI2的表达。这是通过表观遗传下调miRNA-34a表达后激活Notch信号介导的。抑制H3K27甲基化和Notch信号通路降低了表达hotair的成纤维细胞以及SSc真皮成纤维细胞中GLI2的表达。重要的是,使用GANT61或siRNA抑制GLI2功能可以减轻HOTAIR诱导的前纤维化表型。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们的数据表明,GLI2在SSc肌成纤维细胞中通过HOTAIR稳定上调表达,并且GLI2介导Notch下游促纤维化标志物的表达。gydF4y2Ba

简介gydF4y2Ba

系统性硬化症(SSc)是一种自身免疫性疾病,最初表现在患者的手和脚的皮肤,那里有细胞外基质的积聚导致皮肤纤维化。该疾病进展到前臂和腿部,在最严重的情况下(弥漫性SSc)到躯干。除了皮肤纤维化,SSc还会导致内脏器官(肺、心脏和肾脏)的组织纤维化。组织成纤维细胞在该疾病中的关键作用已被明确描述。许多信号通路,如转化生长因子β (TGF-β) [gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba],刺猬音(嘘)[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]及Notch信号[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]与驱动肌成纤维细胞活化有关,但它们的确切作用和相互作用尚不完全清楚。当从组织中外植时,表观遗传因素在SSc肌成纤维细胞维持其表型的能力中起着关键作用[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba].我们最近发现,长链非编码RNA HOTAIR与polycomb repressor complex 2 (PRC2)合作,驱动H3K27me3组蛋白甲基化并沉默miRNA-34a的表达。这导致mirna -34a靶向Notch1的表达增加,从而增加Notch信号通路和肌成纤维细胞活化[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba].gydF4y2Ba

Notch信号是细胞间通信的重要调节器[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba].当配体结合时,Notch受体被γ分泌酶切割,导致Notch胞内结构域(NID)的释放。反过来,NID与转录因子CSL结合[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]并启动一系列下游转录因子的转录,包括Hes1 [gydF4y2Ba14gydF4y2Ba],此前已证明在SSc患者皮肤和成纤维细胞中上调[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba].Notch信号抑制可阻断SSc成纤维细胞中促纤维化标志物的表达[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba].在notch介导的SSc成纤维细胞激活中起作用的下游转录因子尚不清楚。在这里,我们开始研究Notch促进SSc成纤维细胞前成纤维表型的分子机制。gydF4y2Ba

Ringuette等人已经证明,在Müller神经胶质中激活Notch可诱导GLI2表达[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba].这些发现与肌萎缩性侧索硬化症中Notch信号抑制导致GLI2水平降低的数据一致[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba].在规范的Hedgehog (Hh)信号转导中,GLI2是主要的转录激活因子[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba].我们和其他人已经证明,GLI1和GLI2在SSc皮肤和成纤维细胞中上调[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba], SHH通路激活在硬皮病和硬化性移植物抗宿主病(GVHD)的组织纤维化发病机制中发挥重要作用[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba].这两条线索让我们假设,在皮肤纤维化过程中观察到的GLI2的激活至少部分是由hotair诱导的NOTCH激活驱动的。gydF4y2Ba

Hh通路对正常胚胎发育至关重要,并在成人组织维护中发挥关键作用[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba].Hh家族成员,如SHH,通过与受体Patched基因1 (PTCH1)结合来启动信号传递[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba].受体结合导致Smoothened (SMO)的抑制[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba],是一种介导下游GLI转录因子激活的GPCR。GLI2和GLI3组成性表达,并通过磷酸化依赖的蛋白酶体加工转化为转录抑制因子而保持非活性[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba].SMO的激活抑制GLI2和GLI3的加工,诱导全长激活子的积累,激活子启动靶基因的转录,其中包括GLI1和PTCH1 [gydF4y2Ba21gydF4y2Ba].gydF4y2Ba

在本研究中,我们证明HOTAIR的表达足以通过Zeste同源性增强子2 (Enhancer of Zeste Homology 2, EZH2)依赖性的miRNA-34a抑制来驱动notch依赖的GLI2表达增加,而抑制GLI2足以减少真皮成纤维细胞的前纤维化表型。gydF4y2Ba

材料和方法gydF4y2Ba

患者的细胞系gydF4y2Ba

3例近期发病的成年SSc患者的前臂手术获得全层皮肤活检,定义为从临床可检测到的皮肤硬化出现开始,疾病持续时间小于18个月。患者符合2013年ACR/EULAR标准的SSc分类,并有LeRoy等人定义的弥漫性皮肤临床亚群[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba].健康和SSc患者从活检中分离并建立成纤维细胞,如所述[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba].简单地说,将分离的健康和SSc成纤维细胞用HTERT逆转录病毒转导以使成纤维细胞永生。当成纤维细胞在第3代和第6代之间时进行实验。所有参与者均提供了参与本研究的书面知情同意书。NRES-011NE向Francesco Del Galdo博士批准了知情同意程序。gydF4y2Ba

小分子抑制剂gydF4y2Ba

GSK126是EZH2甲基化转移酶抑制剂。最终浓度为5 μM,购自LKT Laboratories。γ分泌酶抑制剂R04929097 (Cayman Chemicals)和DAPT (Tocris)的最终浓度分别为1 μM和10 μM。GLI抑制剂GANT61的最终浓度为10 μM (Selleck)。所有抑制剂在DMSO中重组,并在完全培养基中,在37°C, 5% CO中加入成纤维细胞48小时gydF4y2Ba2gydF4y2Ba的气氛。选择抑制剂浓度是因为在之前的研究中,它们已经证明可以有效地阻断SSc成纤维细胞中各自的通路[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba].gydF4y2Ba

慢病毒转导gydF4y2Ba

从健康对照前臂活检中培养成纤维细胞,并使用逆转录病毒表达人端粒酶(hTERT)使其永生,如前所述[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba].以携带HOTAIR基因序列的GIPZ慢病毒为对照,在嘌呤霉素抗性基因和GFP荧光色素基因的框架内转导,诱导HOTAIR表达(Open Biosystems, Surrey, UK)。为此,将细胞接种在50%合流的无血清DMEM中,用慢病毒颗粒感染细胞,孵育6小时,之后再加入1 ml含10% FCS的DMEM,再孵育72小时。在无菌条件下,通过荧光激活细胞分选,稳定转导的细胞被GFP荧光正选(BD内流)。在含1.0 μg/ml嘌呤霉素(Life Technologies)的培养基中筛选阳性分选的细胞10天。gydF4y2Ba

miRNA-34a转染gydF4y2Ba

使用Lipofectamine 2000转染试剂将67 nM的miRNA-34a模拟物或阴性对照的scramble miRNA(均来自Qiagen)转染成纤维细胞。在收获前,将成纤维细胞培养48小时。gydF4y2Ba

小干扰rna转染GLI2gydF4y2Ba

使用Lipofectamine 2000转染试剂将GLI2特异性的4个siRNA双链(针对mRNA的不同区域)或阴性对照杂化siRNA(均来自Qiagen)转染成纤维细胞。在收获前,将成纤维细胞培养48小时。gydF4y2Ba

音猬因子的刺激gydF4y2Ba

用含0.5%胎牛血清的DMEM对Scramble和hotair表达的成纤维细胞进行血清饥饿24小时,然后用2 μg/ml SHH配体(R&D系统)刺激24小时。gydF4y2Ba

免疫荧光gydF4y2Ba

成纤维细胞生长在玻璃覆盖物上,4%多聚甲醛固定,0.1% Triton X-100在PBS中渗透。用小鼠α-SMA抗体(Abcam ab7817)或乙酰化α-微管蛋白染色,并用Alexa 594标记的Ab (thermolife Technologies)进行可视化。用4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)对细胞核进行复染,用Invitrogen法制备延长金。纤毛长度用ImageJ软件测量。4次独立实验,每个实验条件下测量30根纤毛。gydF4y2Ba

西方墨点法gydF4y2Ba

总蛋白从RIPA缓冲液中提取,通过SDS-PAGE (10-15% Tris-Glycine)分离,转移到Hybond硝化纤维膜(Amersham Biosciences),并使用alpha平滑肌肌动蛋白(α-SMA) (Abcam ab7817)、Notch1(细胞信号3608)、H3K27me3 (Abcam ab6002)、β-肌动蛋白(Sigma A5441)、GLI1 (Santa Cruz sc-515751)和GLI2 (Novus bioologicals AF3635)特异性抗体探针。在Biorad ChemiDoc成像系统上使用物种特异性酶标二抗(Sigma)和ECL (Thermo/Pierce)对免疫印迹进行可视化。gydF4y2Ba

定量实时聚合酶链反应gydF4y2Ba

按照制造商的规程,使用RNA提取试剂盒(Zymo Research)从细胞中提取RNA。用cDNA合成试剂盒(Thermo)逆转录1微克的RNA。Q-RT-PCR分析使用SYBR绿色PCR mastermix工具包(热)使用引物的PCR仪(热)特定GLI1 (GGACCTGCAGACGGTTATCC,反向AGCCTCCTGGAGATGTGCAT), GLI2 (TTTATGGGCATCCTCTCTGG,反向TTTTGCATTCCTTCCTGTCC), Ptch1 (CGATGGAGTCCTTGCCTACAA,反向CCACCAGACGCTGTTTAGTCA),胶原蛋白1型a1 (CCTCCAGGGCTCCAACGAG,反向TCTATCACTGTCTTGCCCCA), 1型a2 (GATGTTGAACTTGTTGCTGAGC,反向TCTTTCCCCATTCATTTGTCTT),alpha SMA(正向tgtatgtggctatccagaggccag,反向agagccagcacgatgccag), CTGF(正向gtgtgctgccaaagatggt,反向ttggagagactcaccgct), Notch 1(正向ccagatgtgaggaaaatcg,反向tcttgcagttgtttcctggttcctggttcc), Hes1(正向TACCCAGCCAGTGTCAAC,反向cagatgctgtctttggttttattcc)和GAPDH(正向acccactcctccacctttgtgtgtgttcccccattcgt)。获得的数据根据ΔΔ C进行分析gydF4y2BatgydF4y2Ba方法。GAPDH为管家基因。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

结果以平均值和标准误差表示。统计分析使用双尾,配对的学生gydF4y2BatgydF4y2Ba测试。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在真皮成纤维细胞中过表达HOTAIR可诱导notch依赖的GLI2表达gydF4y2Ba

Notch信号通路可以增强转录因子GLI2的表达[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba],而HOTAIR可调节成纤维细胞中Notch的表达[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba].因此,我们首先研究了HOTAIR是否调控了真皮成纤维细胞中GLI2的表达。如前所述,生成过表达HOTAIR的皮肤成纤维细胞[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba],并显示稳定的H3K27me3水平增加,正如预期的那样(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa),由于HOTAIR对PRC2复合物具有刺激作用[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba].如前所述,HOTAIR诱导NOTCH信号通路的增加是由转录活性的NOTCH胞内结构域(NID)水平的增加所决定的(图1)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa). HOTAIR过表达增加了两种蛋白的GLI2表达(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa, b)和mRNA水平(图。gydF4y2Ba1gydF4y2BaC)分别增加6倍和3倍(gydF4y2BapgydF4y2Ba均< 0.05)。为了确定hotair介导的GLI2上调是否是Notch信号增强的结果,我们研究了γ分泌酶抑制剂R04929097存在时GLI2的水平。如图所示。gydF4y2Ba1gydF4y2Bad和e, R04929097处理(1 μM处理48 h)降低了hotair表达成纤维细胞中GLI2的表达,但未改变分化成纤维细胞中GLI2的水平。我们证实R04929097可以有效抑制NOTCH信号,因为我们观察到了NID水平的降低和转录的降低gydF4y2BaHES1gydF4y2BaNotch的下游靶基因(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bad, f)。gydF4y2Ba

图1gydF4y2Ba
图1gydF4y2Ba

HOTAIR在真皮成纤维细胞中的表达增加了notch依赖的GLI2转录。用含有scramble或HOTAIR序列的慢病毒转导真皮成纤维细胞。从这些细胞中提取RNA和蛋白质。gydF4y2Ba一个gydF4y2Bawestern blot检测GLI2、H3K27m3、NID蛋白水平。β-肌动蛋白作为装填对照。gydF4y2BabgydF4y2Ba图为GLI2 western blot密度分析的平均值和标准误差。gydF4y2BacgydF4y2BaGLI2gydF4y2Ba分析了转录水平。图表表示三个独立实验的平均值和标准误差。从表达hotair和scramble的成纤维细胞中提取RNA和蛋白。此外,gamma分泌酶抑制剂R04929097处理scramble和hotair表达的成纤维细胞。gydF4y2BadgydF4y2Bawestern blot检测GLI2和NID蛋白水平。β-肌动蛋白作为装填对照。gydF4y2BaGLI2gydF4y2Ba(gydF4y2BaegydF4y2Ba),gydF4y2BaHES1gydF4y2Ba(gydF4y2BafgydF4y2Ba)的转录水平进行分析。图表表示三个独立实验的平均值和标准误差。从健康和SSc成纤维细胞中提取RNA。此外,健康和SSc成纤维细胞使用伽马分泌酶抑制剂R04929097处理。gydF4y2BaHES1gydF4y2Ba(gydF4y2BaggydF4y2Ba),gydF4y2BaGLI2gydF4y2Ba(gydF4y2BahgydF4y2Ba)的转录水平进行分析。图表表示三个独立实验的平均值和标准误差。从健康和SSc成纤维细胞中提取RNA。此外,用γ分泌酶抑制剂DAPT治疗健康和SSc成纤维细胞。gydF4y2BaHES1gydF4y2Ba(gydF4y2Ba我gydF4y2Ba),gydF4y2BaGLI2gydF4y2Ba(gydF4y2BajgydF4y2Ba)的转录水平进行分析。图表表示三个独立实验的平均值和标准误差gydF4y2Ba* p。gydF4y2Ba< 0.05, * *gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01,* * *gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001gydF4y2Ba

重要的是,SSc患者来源的成纤维细胞显示增加gydF4y2BaHES1gydF4y2Ba信使rna水平(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2BaG),与先前报告的数据一致[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba].gydF4y2BaHES1gydF4y2BaR04929097能有效抑制基因表达的增加。在这种情况下,抑制NOTCH信号通路降低了gydF4y2BaGLI2gydF4y2Ba达到与健康对照组难以区分的水平。gydF4y2Ba1gydF4y2Bah),表明SSc中NOTCH信号上调驱动GLI2上调。R04929097没有改变gydF4y2BaGLI2gydF4y2Ba健康成纤维细胞的水平(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bah).为了排除伽马分泌酶抑制剂的脱靶效应,我们使用了另一种作用模式不同的伽马分泌酶抑制剂(DAPT)。与RO4929097一致,DAPT抑制SSc成纤维细胞中的Notch信号降低gydF4y2BaHES1gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba我),gydF4y2BaGLI2gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Baj)转录水平。gydF4y2Ba

有趣的是,hotair诱导的GLI2对真皮成纤维细胞中NOTCH1表达的维持没有作用,因为我们观察到转染GLI2 siRNA的hotair表达成纤维细胞中NOTCH1的表达没有减少(Suppl。无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2BaA-B)或GLI抑制剂GANT61 (Suppl。无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba同样,SSc成纤维细胞中GLI2缺失不影响NOTCH1水平(supl。无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Bad e)。gydF4y2Ba

在表达hotair的成纤维细胞中,GLI2的上调是通过抑制miRNA-34a介导的gydF4y2Ba

之前,我们已经证明HOTAIR通过抑制miRNA-34a来增强NOTCH1的表达[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba].因此,我们假设HOTAIR抑制miRNA-34a的能力可能对GLI2的表达很重要。为了验证这一假设,我们在表达hotair的成纤维细胞中转染了miRNA-34a模拟miRNA或打乱对照miRNA。miRNA-34a表达挽救减少gydF4y2BaGLI2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNOTCH1gydF4y2Ba表达hotair的成纤维细胞的mRNA水平(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa, b).在SSc成纤维细胞中转染miRNA-34a mimic也可显著降低gydF4y2BaGLI2gydF4y2Ba表达水平(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Bad).机制上,miRNA-34a抑制gydF4y2BaNOTCH1gydF4y2BaSSc成纤维细胞的转录本(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bae)。值得注意的是,miRNA-34a模拟转染在HOTAIR-和SSc成纤维细胞中均比基础转染增加2 - 2.5倍的表达(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac, f),提示miRNA-34a的微小变化足以下调gydF4y2BaNOTCH1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaGLI2gydF4y2Ba表达式。综上所述,这些数据表明,HOTAIR具有刺激性gydF4y2BaGLgydF4y2BaI2gydF4y2BamiRNA-34a通过下调miRNA-34a表达,从而控制gydF4y2BaNOTCH1gydF4y2Ba.gydF4y2Ba

图2gydF4y2Ba
图2gydF4y2Ba

HOTAIR通过抑制miRNA-34a增强notch介导的GLI2表达。用miRNA-34a mimic或打乱miRNA mimic转染hotair表达的成纤维细胞,提取RNA。gydF4y2BaGLI2gydF4y2Ba(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba),gydF4y2BaNOTCH1gydF4y2Ba(gydF4y2BabgydF4y2Ba和miRNA-34a (gydF4y2BacgydF4y2Ba)的转录水平进行分析。图表表示三个独立实验的平均值和标准误差。从转染miRNA-34a mimic或混叠miRNA mimic的SSc成纤维细胞中提取RNA。gydF4y2BaGLI2gydF4y2Ba(gydF4y2BadgydF4y2Ba),gydF4y2BaNOTCH1gydF4y2Ba(gydF4y2BaegydF4y2Ba和miRNA34a (gydF4y2BafgydF4y2Ba)的转录水平进行分析。图表表示三个独立实验的平均值和标准误差gydF4y2Ba.gydF4y2Ba*gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05, * *gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01,* * *gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001gydF4y2Ba

HOTAIR通过EZH2介导的表观遗传变化驱动GLI2的表达gydF4y2Ba

lncRNA HOTAIR最著名的作用之一是激活多梳阻遏复合体(PRC2) [gydF4y2Ba25gydF4y2Ba].因此,我们研究了在表达hotair的成纤维细胞中抑制PRC2酶EZH2是否会影响GLI2的表达。用EZH2抑制剂GSK126处理表达hotair的成纤维细胞48 h后明显降低gydF4y2BaGLI2gydF4y2Ba转录水平,但抑制剂对其没有影响gydF4y2BaGLI2gydF4y2Ba成纤维细胞的水平(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa).与这些发现一致的是,我们观察到,经抑制剂处理的表达hotair的成纤维细胞中,GLI2蛋白明显减少(gsk126处理的成纤维细胞中减少70%)(图1)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab).我们还观察到GSK126处理的表达hotair的成纤维细胞中α-SMA和NID水平降低(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaB),如前所述[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba].在SSc患者来源的成纤维细胞中抑制EZH2也产生了类似的结果。在SSc成纤维细胞中,GSK126处理减少gydF4y2BaGLI2gydF4y2BamRNA水平降低45% (gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)(图gydF4y2Ba3.gydF4y2Bac).有趣的是,与GSK126结构相似的第二种EZH2抑制剂GSK503也显示出类似的抑制结果gydF4y2BaGLI2gydF4y2BamRNA水平与来自健康对照皮肤活检的真皮成纤维细胞相当(数据未显示)。gydF4y2Ba

图3gydF4y2Ba
图3gydF4y2Ba

HOTAIR在HOTAIR表达和SSc成纤维细胞中通过EZH2驱动GLI2转录。从表达hotair和scramble的成纤维细胞中提取RNA和蛋白。此外,用EZH2抑制剂GSK126处理scramble和hotair表达的成纤维细胞。gydF4y2Ba一个gydF4y2BaGLI2gydF4y2Ba分析了转录水平。图表示三个独立实验的平均值和标准误差。gydF4y2BabgydF4y2Bawestern blot检测GLI2、α-SMA和NID蛋白水平。β-肌动蛋白作为装填对照。gydF4y2BacgydF4y2Ba从健康和SSc成纤维细胞中提取RNA。此外,用EZH2抑制剂GSK126处理健康和SSc成纤维细胞。gydF4y2BaGLI2gydF4y2Ba分析了两种抑制剂的转录水平。图表表示三个独立实验的平均值和标准误差gydF4y2Ba.gydF4y2Ba*gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05, * *gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01,* * *gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001gydF4y2Ba

HOTAIR过表达导致异常的规范Hedgehog信号通路gydF4y2Ba

GLI2是Hh通路的主要转录激活因子。在没有Hh配体刺激的情况下,GLI2以两种形式存在:全长低活性激活子和较短的加工过的转录抑制子。当Hh配体与PTCH1结合后,加工被抑制,全长GLI2在初级纤毛被磷酸化,以最大限度地增加其转录活性[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba].GLI2激活导致gydF4y2BaGLI1gydF4y2Ba以及其他GLI靶基因的上调,如gydF4y2BaPTCH1。gydF4y2Ba为了确定HOTAIR上调GLI2是否导致典型Hh通路的激活,我们量化了gydF4y2BaGLI1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaPTCH1gydF4y2Ba这是glii依赖转录的特征。如图所示。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa和b,在表达scramble和hotair的成纤维细胞中,GLI1的蛋白和转录水平表达相似。然而,我们观察到1.6倍的上调gydF4y2BaPTCH1gydF4y2Ba信使rna水平(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac)通过沉默GLI2表达来阻止(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bad)。接下来,我们评估了EZH2/Notch/miRNA-34a通路的调节剂对GLI1水平的影响。与上调GLI2诱导GLI1的缺失一致,我们观察到EZH2和伽马分泌酶抑制剂以及miRNA-34a对hotair表达成纤维细胞中GLI1的表达没有影响(图SgydF4y2Ba2gydF4y2BaA)或SSc成纤维细胞(图SgydF4y2Ba2gydF4y2BaB)。gydF4y2Ba

图4gydF4y2Ba
图4gydF4y2Ba

HOTAIR过表达不诱导GLI1表达,阻止shh介导的GLI1诱导。用含有scramble或HOTAIR序列的慢病毒转导真皮成纤维细胞。从这些细胞中提取RNA和蛋白质。gydF4y2Ba一个gydF4y2Bawestern blot分析GLI1和NID蛋白水平。β-肌动蛋白作为装填对照。gydF4y2BaGLI1gydF4y2Ba(gydF4y2BabgydF4y2Ba),gydF4y2BaPTCH1gydF4y2Ba(gydF4y2BacgydF4y2Ba)的转录水平进行分析。图表表示三个独立实验的平均值和标准误差。从表达hotair和scramble的成纤维细胞中提取RNA。另外,用GLI2 siRNA转染scramble和hotair表达的成纤维细胞。转染干扰对照siRNA作为对照。gydF4y2BaPTCH1gydF4y2Ba(gydF4y2BadgydF4y2Ba)转录水平评估。图表表示三个独立实验的平均值和标准误差。gydF4y2BaegydF4y2Ba从血清耗尽的scramble和表达hotair的成纤维细胞中提取RNA。另外,用SHH配体刺激表达scramble和hotair的成纤维细胞24小时。gydF4y2BaGLI1gydF4y2Ba分析了转录水平。图表示三个独立实验的平均值和标准误差。gydF4y2BafgydF4y2Ba将表达Scramble和hotair的成纤维细胞染色,以获得乙酰化α-微管蛋白特异性抗体,并用Alexa 594标记的二抗进行显像。用DAPI显示细胞核(蓝色)。图片是单细胞放大倍数为63,插入部分视野更宽。图中为4个独立实验的平均纤毛长度,实验中测量了30个细胞gydF4y2Ba.gydF4y2Ba*gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05, * *gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01,* * *gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001gydF4y2Ba

考虑到较高水平的GLI2可能会提高表达hotair的成纤维细胞对Hh配体的敏感性,我们研究了它们对SHH的反应性。我们用2 μg/ml的SHH刺激scramble和hotair表达成纤维细胞24小时。出乎意料的是,混乱的细胞显示了6倍的增长gydF4y2BaGLI1gydF4y2Ba表达hotair的成纤维细胞对SHH的响应较弱,约为2倍(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bae).我们怀疑HOTAIR表达可能改变原发性纤毛,这对典型的SHH信号通路至关重要[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba].然而,乙酰化α-微管蛋白染色显示,HOTAIR没有改变纤毛的长度或大体结构(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Baf)。gydF4y2Ba

GLI2对hotair介导的肌成纤维细胞转化至关重要gydF4y2Ba

为了确定在hotair表达细胞中观察到的GLI2表达的增加是否是一种促纤维化激活的介质,我们用siRNA在表达hotair的成纤维细胞中沉默GLI2,并评估促纤维化标志物的表达。减少gydF4y2BaGLI2gydF4y2Ba在hotair表达的成纤维细胞中,80%的mRNA水平降低了促纤维化标志物的表达gydF4y2BaαsmagydF4y2Ba,gydF4y2BaCOL1A1gydF4y2Ba,gydF4y2BaCOL1A2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaCTGFgydF4y2Ba(增刊。gydF4y2Ba1gydF4y2BaB和无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa e)。在混乱对照成纤维细胞中缺失GLI2对促纤维化标志物表达没有影响。这表明,GLI2是HOTAIR激活成纤维细胞的重要中介因子。在互补的方法中,我们用双GLI1/GLI2抑制剂GANT61处理表达hotair的成纤维细胞48小时。GANT61降低了表达hotair的成纤维细胞中α-SMA蛋白的水平(图1)。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa - c)。GANT61治疗减少gydF4y2BaPTCH1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaGLI2gydF4y2Ba水平(无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2BaD, e),表明抑制剂起作用。此外,我们观察到mRNA水平的降低gydF4y2BaCOL1A1gydF4y2Ba,gydF4y2BaCOL1A2gydF4y2Ba,gydF4y2BaαsmagydF4y2Ba而且gydF4y2BaCTGFgydF4y2Ba表达hotair的成纤维细胞经GLI抑制剂处理后的转录水平(图;gydF4y2Ba6gydF4y2Ba外:我)。gydF4y2Ba

图5gydF4y2Ba
图5gydF4y2Ba

GLI2沉默导致hotair介导的成纤维细胞活化减少。从表达hotair和scramble的成纤维细胞中提取RNA和蛋白。另外,用GLI2特异性siRNA转染scramble和hotair表达的成纤维细胞。将混乱对照siRNA转染到其他细胞条件下。gydF4y2Ba一个gydF4y2Bawestern blot检测α-SMA和GLI2蛋白水平。β-肌动蛋白作为装填对照。gydF4y2BaαsmagydF4y2Ba(gydF4y2BabgydF4y2Ba),gydF4y2BaCOL1A1gydF4y2Ba(gydF4y2BacgydF4y2Ba),gydF4y2BaCOL1A2gydF4y2Ba(gydF4y2BadgydF4y2Ba),gydF4y2BaCTGFgydF4y2Ba(gydF4y2BaegydF4y2Ba)的转录水平通过qPCR进行评估。图表表示三个独立实验的平均值和标准误差gydF4y2Ba.gydF4y2Ba*gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05, * *gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01,* * *gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001gydF4y2Ba

图6gydF4y2Ba
图6gydF4y2Ba

抑制GLI2导致hotair介导的成纤维细胞活化减少。从表达hotair和scramble的成纤维细胞中提取RNA和蛋白。此外,用GLI抑制剂GANT61处理表达hotair的成纤维细胞。gydF4y2Ba一个gydF4y2Bawestern blot检测α-SMA蛋白水平。β-肌动蛋白作为装填对照。gydF4y2BabgydF4y2Ba图中为α-SMA western blots密度测定分析的平均值和标准误差。gydF4y2BacgydF4y2Ba用α-SMA特异性抗体对Scramble和hotair表达的成纤维细胞进行染色。此外,用GANT61处理表达hotair的成纤维细胞。α-SMA抗体与小鼠特异性Alexa 594偶联的二抗进行可视化。用DAPI显示细胞核(蓝色)。红色标尺代表20 μm。gydF4y2BaPTCH1gydF4y2Ba(gydF4y2BadgydF4y2Ba),gydF4y2BaGLI2gydF4y2Ba(gydF4y2BaegydF4y2Ba),gydF4y2BaCOL1A1gydF4y2Ba(gydF4y2BafgydF4y2Ba),gydF4y2BaCOL1A2gydF4y2Ba(gydF4y2BaggydF4y2Ba),gydF4y2BaαsmagydF4y2Ba(gydF4y2BahgydF4y2Ba),gydF4y2BaCTGFgydF4y2Ba(gydF4y2Ba我gydF4y2Ba)的转录水平进行分析。图表表示三个独立实验的平均值和标准误差gydF4y2Ba.gydF4y2Ba*gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05, * *gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01,* * *gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001gydF4y2Ba

通过siRNA缺失或GANT61抑制GLI2下调,可降低SSc成纤维细胞中纤维化标志物的表达水平。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba模拟和gydF4y2Ba8gydF4y2BaA-h),如前所述[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba].综上所述,这些数据表明,HOTAIR调节GLI2表达的能力对其诱导前纤维化激活的能力至关重要(图1)。gydF4y2Ba8gydF4y2Bal)。gydF4y2Ba

图7gydF4y2Ba
图7gydF4y2Ba

GLI2缺失导致SSc成纤维细胞中促纤维化标志物表达减少。从健康和SSc成纤维细胞中提取RNA。此外,将健康的和SSc成纤维细胞转染GLI2特异性siRNA。将混乱对照siRNA转染到其他细胞条件下。gydF4y2BaPTCH1gydF4y2Ba(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)gydF4y2BaαsmagydF4y2Ba(gydF4y2BabgydF4y2Ba),gydF4y2BaCOL1A1gydF4y2Ba(gydF4y2BacgydF4y2Ba),gydF4y2BaCTGFgydF4y2Ba(gydF4y2BadgydF4y2Ba)的转录水平通过qPCR进行评估。图表表示三个独立实验的平均值和标准误差gydF4y2Ba.gydF4y2Ba*gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05, * *gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01,* * *gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001gydF4y2Ba

图8gydF4y2Ba
图8gydF4y2Ba

抑制GLI2可降低SSc成纤维细胞中促纤维化标志物。从健康和SSc成纤维细胞中提取RNA和蛋白质。此外,用Gli抑制剂GANT61处理SSc成纤维细胞。gydF4y2Ba一个gydF4y2Bawestern blot检测α-SMA蛋白水平。β-肌动蛋白作为装填对照。gydF4y2BabgydF4y2Ba图中显示了α-SMA western blots的密度测定分析的平均值和标准误差。gydF4y2BaPTCH1gydF4y2Ba(gydF4y2BacgydF4y2Ba),gydF4y2BaGLI2gydF4y2Ba(gydF4y2BadgydF4y2Ba),gydF4y2BaCOL1A1gydF4y2Ba(gydF4y2BaegydF4y2Ba),gydF4y2BaCOL1A2gydF4y2Ba(gydF4y2BafgydF4y2Ba),gydF4y2BaαsmagydF4y2Ba(gydF4y2BaggydF4y2Ba),gydF4y2BaCTGFgydF4y2Ba(gydF4y2BahgydF4y2Ba)的转录水平进行分析。图表表示三个独立实验的平均值和标准误差。gydF4y2Ba我gydF4y2BaHOTAIR/EZH2/miRNA-34a/ notch介导的GLI2激活示意图。*gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05, * *gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01,* * *gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

SHH在SSc皮肤和血清中表达上调[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba], PTCH1、PTCH2及转录因子GLI1、GLI2表达增加[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba].然而值得注意的是,与GLI1不同,GLI2不是Hh通路的转录靶点,其在SSc中的过表达被认为是已知的TGF-β/ smad诱导的激活gydF4y2BaGLI2gydF4y2Ba启动子(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba].研究表明,成纤维细胞中Hh信号的激活会上调肌成纤维细胞激活的标志物,如COL1A1, COL2A1和α-SMA,并增加应力纤维形成[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba].文献数据显示,体外培养的SSc成纤维细胞保持了高水平的GLI2表达。这表明表观遗传因素在这一观察中发挥了重要作用。在本研究中,我们发现PRC2复合物与lncRNA HOTAIR协同,通过增强Notch信号通路的能力,在体外驱动GLI2的表达。gydF4y2Ba

本文提供的数据进一步揭示了HOTAIR驱动真皮成纤维细胞活化的能力。在本研究中,我们发现HOTAIR部分通过增加促纤维化的GLI2蛋白的表达来驱动真皮成纤维细胞中的促纤维化标志物。这是通过抑制miRNA-34a介导的,该miRNA-34a释放NOTCH1抑制并导致GLI2转录。至于NID(与转录因子CSL合作)是否直接与GLI2启动子结合并启动转录,还是该通路中还有其他中间体,仍存在疑问。此外,目前尚不清楚GLI2是否直接启动了SSc成纤维细胞中促纤维化标志物的转录。这些都是有待进一步研究的有趣问题。gydF4y2Ba

在SSc中,GLI2的转录被证明是由TGF-β驱动的[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba].因此,HOTAIR/Notch可能与TGF-β共同促进GLI2表达。有证据表明Notch与TGF-β信号通路之间存在合作关系。Notch信号与phospho-SMAD活性有关[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba], TGF-β刺激可通过Notch胞内结构域与SMAD3的相互作用增强Hes1表达[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba].在SSc成纤维细胞中,HOTAIR可能通过增强Notch的表达激活成纤维细胞,从而使TGF-β增强GLI2的表达。gydF4y2Ba

这项研究的一个警告是,HOTAIR增强了GLI2的表达,而不是GLI1。这很有趣,因为GLI1是Hh通路中GLI2的主要转录靶点[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba].Hh信号主要起源于细胞表面的纤毛。因此,HOTAIR可能会改变成纤维细胞的纤毛功能,从而改变成纤维细胞对SHH的反应方式。我们证明HOTAIR不会改变纤毛的长度。gydF4y2Ba4gydF4y2Baf)但它可能会改变它们的组成或超微结构,这可能会阻止表达hotair的成纤维细胞对SHH的反应能力。gydF4y2Ba

最后,这项研究的意义超出了纤维性疾病。Hh通路在许多癌症中被过度表达和解除调控[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba].有新的证据表明HOTAIR在一些癌症中也过度表达[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba],这表明HOTAIR可能在癌症的SHH调节失调中发挥了作用。总之,HOTAIR表达对GLI2的影响为PRC2在纤维化过程中驱动的深刻表观遗传学变化提供了重要的机制,这将是可行的治疗靶向。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们已经发现了一种新的机制,hh -应答转录因子GLI2在SSc成纤维细胞中上调。长链非编码RNA HOTAIR通过增强Notch信号增强GLI2的表达。这让我们对hotair介导的系统性硬化症纤维化有了更深入的了解。gydF4y2Ba

数据和材料的可用性gydF4y2Ba

在研究过程中产生或分析的所有数据都包含在本文发表的文章中。在当前研究期间和/或分析的数据集可从通信作者在合理的要求。gydF4y2Ba

缩写gydF4y2Ba

SSc:gydF4y2Ba

系统性硬化病gydF4y2Ba

EZH2:gydF4y2Ba

Zeste同源增强器gydF4y2Ba

TGF -β:gydF4y2Ba

转化生长因子gydF4y2Ba

PRC2:gydF4y2Ba

Polycomb阻遏复合物2gydF4y2Ba

NID:gydF4y2Ba

切口胞内域gydF4y2Ba

移植物抗宿主病:gydF4y2Ba

移植物抗宿主病gydF4y2Ba

SMO:gydF4y2Ba

平和gydF4y2Ba

PTCH1:gydF4y2Ba

打补丁的1gydF4y2Ba

Hh:gydF4y2Ba

刺猬gydF4y2Ba

嘘:gydF4y2Ba

声波刺猬gydF4y2Ba

αsma:gydF4y2Ba

平滑肌肌动蛋白gydF4y2Ba

参考文献gydF4y2Ba

  1. Kawakami T, Ihn H, Xu W, Smith E, LeRoy C, Trojanowska M.硬皮病成纤维细胞tgf - β受体表达增加:自分泌tgf - β信号通路对硬皮病表型贡献的证据。中国皮肤科杂志。1998;110:47-51。gydF4y2Ba

    中科院gydF4y2Ba文章gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  2. 黄俊,黄志明,张志明,徐旭,等。酪氨酸磷酸酶SHP2控制tgf β诱导的STAT3信号通路来调节成纤维细胞活化和纤维化。Nat Commun。2018;9:3259。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  3. 刘志强,刘志强,刘志强,刘志强,等。转化生长因子β激活通过下调轴蛋白2启动典型Wnt信号。关节炎Rheumatol。2018;70:932-42。gydF4y2Ba

    中科院gydF4y2Ba文章gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  4. 刘志强,刘志强,刘志强,等。酰基转移酶瘦刺猬调节tgf β依赖性成纤维细胞活化的SSc。Ann Rheum Dis. 2019; 78:1269-73。gydF4y2Ba

    中科院gydF4y2Ba文章gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  5. 张志强,张志强,张志强,等。在系统性硬化症中,刺猬信号控制成纤维细胞活化和组织纤维化。关节炎Rheumatol。2012;64:2724-33。gydF4y2Ba

    中科院gydF4y2Ba文章gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  6. 刘志强,刘志强,刘志强,等。抑制刺猬信号通路治疗小鼠硬皮病慢性移植物抗宿主病。血。2012;120:2909-17。gydF4y2Ba

    中科院gydF4y2Ba文章gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  7. 张志强,张志强,张志强,等。在系统性硬化症中,Notch信号调节成纤维细胞活化和胶原蛋白释放。2011; 70:1304-10。gydF4y2Ba

    中科院gydF4y2Ba文章gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  8. 张志强,张志强,张志强,等。Notch信号的抑制可防止实验性纤维化并诱导已建立纤维化的消退。关节炎Rheumatol。2011;63:1396 - 404。gydF4y2Ba

    中科院gydF4y2Ba文章gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  9. 王勇,王晓燕,王晓燕,王晓燕。系统性硬化症发病机制的研究进展。风湿病学(牛津大学)。2015; 54:1759 - 70。gydF4y2Ba

    中科院gydF4y2Ba文章gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  10. 张志强,张志强,张志强,等。抑制EZH2可预防硬皮病纤维化并恢复正常血管生成。中国科学:地球科学(英文版)2019;gydF4y2Ba

    中科院gydF4y2Ba文章gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  11. 王志强,王志强,王志强,王志强,等。在系统性硬化症中,长链非编码RNA HOTAIR通过miRNA 34a依赖性NOTCH激活来驱动ezh2依赖性肌成纤维细胞激活。安·莱茵2020;79:507-17。gydF4y2Ba

    中科院gydF4y2Ba文章gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  12. Hori K, Sen A, Artavanis-Tsakonas S. Notch信号一目了然。中国生物医学工程学报。2013;26(3):391 - 396。gydF4y2Ba

    中科院gydF4y2Ba文章gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  13. Pursglove SE, Mackay JPCSL:比其他的略胜一筹。国际生物化学杂志2005;37(7):372 - 379。gydF4y2Ba

    中科院gydF4y2Ba文章gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  14. Andersson ER, Sandberg R, Lendahl U. Notch信号:设计简单,功能多样。发展。2011;138:3593 - 612。gydF4y2Ba

    中科院gydF4y2Ba文章gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  15. 斑马鱼脊髓模式形成过程中,Notch信号通过glii依赖机制维持Hedgehog反应。Elife。2019;8:e49252。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  16. Ringuette R, Atkins M, Lagali PS, Bassett EA, Campbell C, Mazerolle C,等。Notch-Gli2轴维持神经前体细胞和Müller胶质细胞的刺猬反应。Dev杂志。2016;411:85 - 100。gydF4y2Ba

    中科院gydF4y2Ba文章gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  17. 马晓东,张晓东,张晓东,张晓东。Notch与Sonic hedgehog信号通路在肌萎缩侧索硬化症小鼠模型中的相互作用。Neuroreport。2017;28:141-8。gydF4y2Ba

    中科院gydF4y2Ba文章gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  18. 刘海燕,陈白,张志强,张志勇,等。小鼠Gli1突变是可行的,但与Gli2突变相结合,SHH信号通路存在缺陷。发展。2000;127:1593 - 605。gydF4y2Ba

    中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  19. 刺猬信号在动物发育中的作用:范式和原则。基因Dev。2001;15:3059 - 87。gydF4y2Ba

    中科院gydF4y2Ba文章gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  20. 张波,庄涛,林强,杨波,徐旭,辛刚,等。patched1 - arhgap36 - pka -逆蛋白轴决定了smoothened对sonic hedgehog通路激活的纤毛转位。中国科学:地球科学(英文版)2019;gydF4y2Ba

    中科院gydF4y2Ba文章gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  21. Robbins DJ, Fei DL, Riobo NA。刺猬信号转导网络。Sci信号。2012;5:re6。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  22. Riobo NA, Lu K, Ai X, Haines GM, Emerson CP Jr. Phosphoinositide 3-kinase和Akt对sonic hedgehog信号通路至关重要。中国科学:地球科学(英文版)2006;gydF4y2Ba

    中科院gydF4y2Ba文章gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  23. Tempé D, Casas M, Karaz S, Blanchet-Tournier MF, Concordet JP。多位点蛋白激酶A和糖原合成酶激酶3 β磷酸化导致SCFbetaTrCP介导Gli3泛素化。中国生物医学杂志2006;26:4316-26。gydF4y2Ba

    文章gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  24. 早期系统性硬化症的分类标准。J Rheumatol。2001;28:1573-6。gydF4y2Ba

    中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  25. 王健林,徐晓东,王健林,等。人类HOX位点非编码rna中活性和沉默染色质区域的功能划分。细胞。2007;129:1311-23。gydF4y2Ba

    中科院gydF4y2Ba文章gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  26. whway G, Nazlaova L, Hancock JT。通过初级纤毛发出信号。Front Cell Dev Biol. 2018; 6:1-13。gydF4y2Ba

  27. 梁荣华,张勇,张永华,等。转录因子GLI2作为转化生长因子-β诱导SSc成纤维细胞活化的下游介质。Ann Rheum Dis. 2017; 76:756-64。gydF4y2Ba

    中科院gydF4y2Ba文章gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  28. 张志强,张志强,张志强,等。血清中超音hedgehog基因水平升高与系统性硬化症的纤维化和血管表现有关。Ann Rheum Dis. 2018; 77:626-8。gydF4y2Ba

    中科院gydF4y2Ba文章gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  29. 刘志强,刘志强,刘志强,等。抑制hedgehog基因信号传导可防止实验性纤维化并诱导已建立的纤维化的消退。杨文华。2012;71:785-9。gydF4y2Ba

    中科院gydF4y2Ba文章gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  30. 张志强,张志强,张志强,等。Notch信号通路和转化生长因子- β (tgf -beta)信号通路协同调控血管平滑肌细胞分化。生物化学学报。2010;285:17556-63。gydF4y2Ba

    中科院gydF4y2Ba文章gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  31. 刘志强,刘志强,刘志强,刘志强,等。Notch与Smad3细胞内域相互作用介导的Notch与tgf - β信号通路的串扰。中国生物医学杂志。2003;33(3):323 - 327。gydF4y2Ba

    中科院gydF4y2Ba文章gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  32. Skoda AM, Simovic D, Karin V, Kardum V, Vranic S, Sermen L.刺猬信号通路在癌症中的作用:综合综述。中华医学杂志。2018;18:8-20。gydF4y2Ba

    中科院gydF4y2Ba文章gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  33. 唐琦,汉SS. HOTAIR:一种在人类癌症中致癌的长链非编码RNA。《细胞生理化学》2018;47:893-913。gydF4y2Ba

    中科院gydF4y2Ba文章gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  34. 古普塔·拉,沙·N,王凯,金J,霍林斯·HM,王dj,等。长链非编码RNA HOTAIR重组染色质状态促进癌症转移。大自然。2010;464:1071-6。gydF4y2Ba

    中科院gydF4y2Ba文章gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

下载参考gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

本文介绍了由英国国家健康研究所(NIHR)利兹生物医学研究中心(BRC)支持的独立研究。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

F.DG获得了苏珊·切尼博士后奖学金。R.W.得到了医学研究理事会DTP学生的支持。gydF4y2Ba

作者信息gydF4y2Ba

作者和联系gydF4y2Ba

作者gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

研究构想与设计:C.W.W., N.A.R.DG。和F.DG。数据采集:C.W.W., R.L.R., c.c ., i.g.和B.W.分析和写入:C.W.W, R.L.R N.A.R.DG。和F.DG。作者阅读并批准了最终稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba弗朗西斯科·德尔·GaldogydF4y2Ba.gydF4y2Ba

道德声明gydF4y2Ba

伦理认可和同意参与gydF4y2Ba

所有参与者均提供了参与本研究的书面知情同意书。知情同意程序由NRES-011NE批准FDG由利兹大学。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

没有一个gydF4y2Ba

额外的信息gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

卡塔尔世界杯常规比赛时间施普林格《自然》对出版的地图和机构附属关系中的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

补充信息gydF4y2Ba

附加文件1:FigureS1。gydF4y2Ba

抑制GLI2不影响NOTCH1的表达。从表达hotair和scramble的成纤维细胞中提取RNA。另外,将表达GLI2特异性siRNA的scramble和HOTAIR成纤维细胞转染。将混乱对照siRNA转染到其他细胞条件下。gydF4y2BaNOTCH1gydF4y2Ba(一)和gydF4y2BaGLI2gydF4y2Ba(B)分析转录水平。图表表示三个独立实验的平均值和标准误差。从表达hotair和scramble的成纤维细胞中提取RNA。此外,用GLI抑制剂GANT61处理表达hotair的成纤维细胞。(C)gydF4y2BaNOTCH1gydF4y2Ba分析了转录水平。图表表示三个独立实验的平均值和标准误差。从健康和SSc成纤维细胞中提取RNA。此外,将GLI2特异性siRNA转染健康和SSc成纤维细胞。将混乱对照siRNA转染到其他细胞条件下。gydF4y2BaNOTCH1gydF4y2Ba(D)和gydF4y2BaGLI2gydF4y2Ba(E)分析了转录水平。图表表示三个独立实验的平均值和标准误差gydF4y2Ba.*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001。gydF4y2Ba图S2。gydF4y2Ba在HOTAIR和SSc成纤维细胞中,GLI1的表达对EZH2和gamma分泌酶抑制剂不敏感。(A)从表达HOTAIR的成纤维细胞中提取RNA。此外,用EZH2抑制剂GSK126和γ分泌酶抑制剂R04929097处理表达HOTAIR的成纤维细胞,并转染miRNA-34a mimic。gydF4y2BaGLI1gydF4y2Ba分析了转录水平。图表示三个独立实验的平均值和标准误差。(B)从SSc成纤维细胞中提取RNA。此外,用EZH2抑制剂GSK126和伽马分泌酶抑制剂R04929097处理SSc成纤维细胞,并转染miRNA-34a mimic。gydF4y2BaGLI1gydF4y2Ba分析了转录水平。图表示三个独立实验的平均值和标准误差。gydF4y2Ba

权利和权限gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文根据知识共享署名4.0国际许可协议授权,该协议允许以任何媒介或格式使用、共享、改编、分发和复制,只要您适当地注明原作者和源代码,提供知识共享许可协议的链接,并说明是否进行了修改。本文中的图像或其他第三方材料均包含在本文的知识共享许可中,除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料不包含在文章的知识共享许可中,并且您的预期使用不被法定法规允许或超过允许的使用,您将需要直接从版权所有者获得许可。如欲查阅本牌照副本,请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba.知识共享公共领域转让豁免书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本文提供的数据,除非在对数据的信用额度中另有说明。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba

关于这篇文章gydF4y2Ba

通过十字标记验证货币和真实性gydF4y2Ba

引用这篇文章gydF4y2Ba

Wasson, C.W, Ross, R.L, Wells, R。gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba在系统性硬化症真皮成纤维细胞中,长链非编码RNA HOTAIR通过Notch信号诱导GLI2的表达。gydF4y2Ba关节炎Res其他gydF4y2Ba22gydF4y2Ba286(2020)。https://doi.org/10.1186/s13075-020-02376-9gydF4y2Ba

下载引用gydF4y2Ba

  • 收到了gydF4y2Ba:gydF4y2Ba

  • 接受gydF4y2Ba:gydF4y2Ba

  • 发表gydF4y2Ba:gydF4y2Ba

  • DOIgydF4y2Ba:gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1186/s13075-020-02376-9gydF4y2Ba

关键字gydF4y2Ba

  • 系统性硬化病gydF4y2Ba
  • 刺猬信号gydF4y2Ba
  • 表观遗传学gydF4y2Ba
  • 长非编码RNAgydF4y2Ba
  • 热空气gydF4y2Ba