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通过RNA-Seq测定骨关节炎患者软骨细胞中糖皮质激素基因表达的广泛调控

摘要

背景

关节内注射糖皮质激素(GC)被广泛用于骨关节炎(OA)的对症治疗。然而,也有人担心它们潜在的有害影响,它们对软骨细胞表型的详细影响仍然知之甚少。

方法

我们用RNA-Seq研究了地塞米松对OA软骨细胞基因表达的影响。软骨细胞从膝关节置换术的OA患者软骨中分离出来,加入或不加入地塞米松培养24小时。对总RNA进行分离和测序,并在基因本体论(GO)数据库中进行功能分析。所选基因经RT-PCR验证。我们还在最近的全基因组表达分析(GWEA)研究中研究了与OA相关的基因。

结果

地塞米松增加了480个基因的表达,减少了755个基因的表达,其倍数变化(FC)大于2.0。与炎症、软骨合成代谢/分解代谢以及脂质和碳水化合物代谢相关的几个基因是受影响最强烈的基因。在GO分析中,影响显著的基因中,涉及细胞外基质组织、细胞增殖和粘附、炎症和胶原合成的基因富集。在网络分析中,NGF、PI3KR1和VCAM1被确定为受地塞米松影响最强烈的中心基因。

结论

这是第一个研究GCs对OA软骨细胞基因表达的全基因组影响的研究。除了明确的抗炎和抗代谢作用外,GCs还影响软骨细胞的脂质和糖代谢,这一观察结果可能对OA的代谢表型特别重要。

简介

骨关节炎(OA)是一种影响全球超过15%的60岁或以上人口的疾病,导致疼痛、残疾和生活质量降低,并给医疗系统带来重大成本[1].关节的疾病过程以氧化应激、低级别炎症和分解代谢增加为特征。这最终导致关节软骨的破坏和关节其他组织的变化,导致疼痛和功能丧失[2].

骨关节炎中软骨细胞基因表达明显改变[3.].其中一些变化被认为是有害的(如蛋白水解酶和促炎细胞因子的表达增加),而另一些则是保护性的(如细胞外基质[ECM]成分的表达增加)[4].此前已经进行了一些全基因组表达分析(GWEAs),将受损的OA软骨与完好的OA软骨或来自健康供体的软骨进行比较[5678].两项较大的研究分别利用微阵列和RNA-Seq比较了同一关节中受损的和健康的OA软骨,确定了一些与炎症、骨骼系统发育、细胞粘附和单糖代谢有关的差异表达基因[910].

由于目前没有经证实的治疗骨性关节炎的改善疾病的药物,所有的药物治疗基本上都是对症治疗[1].关节内注射糖皮质激素(GCs)被广泛用于对抗炎症和疼痛,并被OARSI推荐[11], ACR [12]和NICE [13膝骨性关节炎的治疗指南。然而,它们的长期疗效尚不清楚,而且个体患者之间的反应似乎存在显著差异[14].GCs被认为可以抑制OA关节中存在的有害的低级别炎症。然而,对于潜在的长期有害影响,也存在一些担忧[1516].

糖皮质激素是肾上腺皮质内产生的类固醇激素。在靶细胞中,它们与糖皮质激素受体(GR)形成复合物,然后二聚体迁移到细胞核中。之后,gc通过两个主要机制产生抗炎作用。gr -类固醇复合物与靶基因启动子区域的糖皮质激素反应元件(GREs)结合,促进抗炎基因以及参与其他各种功能的许多基因的表达。此外,GCs可以抑制活化B细胞核因子kappa-轻链增强子(NF-κB)和激活蛋白1 (AP-1)等炎症转录因子的活性,并隔离其辅激活因子,从而抑制各种炎症基因的表达,减轻炎症[17].在软骨细胞中,糖皮质激素也被证明通过诱导氧化应激和凋亡降低软骨细胞活力[18].除了对炎症的影响外,糖皮质激素对糖脂代谢的调节也可以调节它们对OA软骨的作用。骨关节炎与代谢紊乱有关,如肥胖和糖尿病,由此产生了所谓的骨性关节炎代谢表型的概念。也有证据表明关节软骨细胞的代谢紊乱,以及糖酵解等障碍[19,胆固醇代谢,[20.]和线粒体呼吸[21已被报道过。由于它们对其他细胞类型中的这些代谢途径已有影响[22],糖皮质激素可能通过影响软骨细胞代谢来影响OA的发病机制。

在目前的研究中,我们开始研究糖皮质激素地塞米松对OA软骨细胞基因表达的影响。目的是确定在OA发病机制中可能重要的显著调节通路和/或基因功能类别。基于RAAK研究的患者资料,我们还将结果与之前两项GWEA研究的结果进行了比较[910,以确定糖皮质激素治疗是否可能“改变”OA软骨细胞的表达谱,使其向健康细胞的表达谱靠拢。此外,我们研究了地塞米松对先前在全基因组关联(GWAS)研究中发现的潜在OA易感基因的影响[232425].

方法

患者与细胞培养

从骨关节炎患者(n= 10, BMI 27.3 [5.8] kg/m2年龄70.0[14.8]岁,中位数[IQR];4/6名女性/男性)在芬兰坦佩雷的Coxa关节置换医院接受全膝关节置换手术。所有患者均符合美国风湿病学会膝关节骨性关节炎分类标准[26],平均Kellgren-Lawrence评分为3.5 (SEM 0.22)。糖尿病患者被排除在研究之外。

按前面所述进行软骨细胞分离和培养[27].关节软骨用手术刀从软骨下骨无菌取出,切成小块。首先用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗这些碎片。之后,在37℃下,将它们在Liberase™酶(Roche Applied Science, Penzberg, Germany, 0.25 mg/mL)的存在下孵育一夜,稀释于Dulbecco 's modified Eagle 's培养基(DMEM, Sigma-Aldrich, St Louis, MO)中,与含有青霉素(100单位/mL)的谷氨酰胺- i (GlutaMAX-I)、链霉素(100 μg/mL)和双性霉素B (250 ng/mL)(所有三种均来自美国CA Carlsbad的Invitrogen公司)。将得到的细胞悬浮液倒入70 μm的尼龙网中,以1500转/分的速度离心5分钟。将细胞洗净,接种于24孔板(20万细胞/mL),孵育24 h。实验开始后,在新鲜培养基(DMEM中添加10%热灭活胎牛血清[龙沙]和上述取代基)中加入地塞米松(1 μM) 24 h。

酶联免疫吸附试验

另一组9个软骨样本用于ELISA测定。软骨制备、软骨细胞分离和培养方法如上所述。24 h后,收集细胞培养基终止孵育,培养基样品在- 20°C保存直至分析。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定人MMP-1、MMP-13和CCL2 (MCP-1)的浓度,所用试剂来自英国阿宾顿175号欧洲研发系统有限公司(目录号分别为DY901、DY511和DY279)。检出限分别为39 pg/mL、31.3 pg/mL和7.8 pg/mL。

RNA分离和样品制备

在指定的时间点去除培养基,用GenElute™哺乳动物总RNA迷你试剂盒(Sigma)提取软骨细胞的总RNA。总RNA用DNAse I处理(Qiagen, Hilden, Germany)。RNA浓度和完整性由2100生物分析仪(安捷伦技术公司)确认。使用TaqMan反转录试剂和随机六聚体(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)将RNA (150ng /样本)反转录为cDNA进行RT-PCR。

下一代测序和数据分析

RNA样本测序(500 ng)在芬兰赫尔辛基的芬兰分子医学研究所(FIMM)测序核心中进行,使用Illumina HiSeq 2500测序平台。测序深度为1500万对端reads长度为100 bp。首先使用FastQC评估读取质量[28],并使用Trimmomatic对读数进行了裁剪[29].用STAR将裁剪后的reads与完整的参考人类基因组对齐[30.].使用featucounts程序[31].用DESeq2评估差异表达,使用患者数量作为两两比较的附加实验因素[32].基因表达水平以deseq2归一化计数给出,所有样本中归一化计数平均值为5或更少的基因被排除在进一步分析之外。为了进一步分析,对丰度变化最小为2.0倍(FC)和错误发现率(FDR)的基因进行了校正p值< 0.05认为具有生物学意义和统计学意义。对基因本体论(GO)数据库进行功能分析[33]使用在GOrilla工具中实现的排序列表丰富[34],并用STRING研究蛋白质相互作用[35].从NCBI基因数据库中获取基因功能。

定量逆转录/聚合酶链反应

将逆转录酶反应得到的cDNA用RNAse-free水稀释1:20,用TaqMan Universal PCR Master Mix和ABI Prism 7500序列检测系统(Applied Biosystems)进行定量RT-PCR。

人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、环氧合酶-2 (COX-2)、MAP激酶磷酸酶1 (MKP-1)、基质金属蛋白酶(MMPs) 1和13、II型胶原蛋白、α 1 (COL2A1)和aggrecan (ACAN)的引物和探针均来自Metabion International AG (Martinsried, Germany)。引物和探针序列(表S1)和浓度根据TaqMan通用PCR Master Mix协议第4304449修订版c中的制造商说明进行优化,使用TagMan基因表达测定法(应用生物系统)测定其他研究基因的mRNA水平:

PCR反应参数为:50°C孵育2 min, 95°C孵育10 min, 95°C变性15 s, 60°C退火延伸1 min,循环40次。每个实验反应都重复进行。表S所列基因的相对mRNA水平1使用在应用生物系统用户公报第2号中描述的标准曲线方法进行量化。为了计算TaqMan法测定的mrna的相对表达量,2(−ΔΔCT)方法使用。根据该方法,循环阈值(CT)的值归一化为CT相同样品中GAPDH mRNA的值。

统计数据

对于NGS数据分析,使用DESeq2中实现的负二项模型进行归一化和差分表达式研究。在ELISA和PCR实验中,配对学生t差异表达的统计学意义采用检验,多重检验采用Bonferroni校正处理。数据以平均值+平均标准误差(SEM)表示。

结果

差异表达基因

经过归一化和多重检测校正后,地塞米松处理的细胞中有480个基因与对照细胞相比上调超过2.0倍,755个基因被同一因子下调(FC <−2.0)。总共发现7371个基因在地塞米松处理的软骨和对照软骨中表达差异,具有统计学意义(fdr校正)p值< 0.05)。其中,3612家上调,3759家下调。表中列出了12个上调和下调最强烈的基因1.地塞米松处理的软骨细胞与未处理的软骨细胞的差异表达基因的完整列表列在表S的补充数据中2

表1地塞米松处理的OA软骨细胞(D)相对于对照(Co)中12个上调和下调最强烈的基因

最强烈上调的基因包括调控细胞增殖、炎症、软骨发育、碳水化合物和脂质代谢的基因。其中,基因下调最强烈的是那些与细胞增殖和分化、细胞外基质产生和炎症相关的基因。还包括神经生长因子(NGF),一种已知的OA疼痛中介因子[36)(表1).

接下来,我们通过排序列表富集GO分析,研究在向两个方向折叠变化最大的基因中,哪些功能基因类别被富集(表2).其中包括与细胞外基质组织、调节细胞增殖、炎症反应、细胞粘附、MAP激酶信号、胶原合成、脂质和碳水化合物代谢相关的蛋白。

表2地塞米松显著影响基因本体排序(GO)术语

参与炎症、氧化应激和细胞外基质生产的基因

由于低级别炎症、氧化应激以及细胞外基质产生和分解代谢的变化是OA发病机制的核心特征,我们着手分别研究与这些过程相关的基因(见表3.).一些促炎因子如环氧合酶-2 (COX-2, fold change−4.29)、趋化因子(C-C motif)配体2 (CCL2, fold change−5.43)和TNF超家族成员15 (TNFSF15, fold change−5.98)在地塞米松作用下显著下调,而抗炎MAP激酶磷酸酶1 (MKP-1, fold change−10.48)和2 (MKP-2, fold change−5.50)则上调。影响氧化应激反应的基因,如克鲁珀尔样因子9 (KLF9,折叠变化10.85)和叉头盒O3 (FOXO3,折叠变化4.29),也同样上调。同时,异化的基质金属蛋白酶1,16日和13(可以与褶皱变化−2.85,与褶皱变化MMP16−3.12和MMP13褶皱变化−4.08)被地塞米松表达下调。各种胶原蛋白被地塞米松下调,包括表达最高的胶原COL2A1(倍变−2.28)和COL11A1(倍变−3.12)。然而,aggrecan被发现显著上调(倍变2.43)。结缔组织生长因子(CTGF,折变2.25)表达增强,成纤维细胞生长因子1 (FGF1,折变−2.62)、转化生长因子β 2 (TGFB2,折变−2.57)和血管内皮生长因子A (VEGFA,折变−2.36)表达下调。所选基因的表达变化经RT-PCR证实(表S3.)和mmp1、13以及CCL2的产生(图S1).

表3在地塞米松处理的OA软骨细胞(D)中与对照(Co)相比,与炎症、氧化应激、分解代谢酶、细胞外基质生成以及生长因子相关的选定基因

碳水化合物和脂质代谢

由于糖皮质激素调节葡萄糖和脂质代谢,而OA已知与代谢综合征相关,我们分别研究了参与碳水化合物和脂质代谢主要途径(糖酵解、氧化磷酸化、脂解和β -氧化)的蛋白质基因[37].地塞米松对这些基因均无显著影响(倍变> 2.0),唯一的例外是上调长链酰基辅酶a脱氢酶(ACADL)(倍变2.60)(表S4).

然而,地塞米松影响了其他几个调节脂质和碳水化合物代谢的基因的表达(这些基因与等级较高的氧化石墨烯术语GO:0019216脂质代谢调控和氧化石墨烯:0006109碳水化合物代谢调控相关)。例如,丙酮酸脱氢酶激酶4 (PDK4)和糖原磷酸化酶L (PYGL),以及氧化还原调节剂Sestrin 3 (SESN3),在地塞米松作用下显著上调(图。1).

图1
图1

受地塞米松和调节碳水化合物(GO:0006109)和脂质(GO:0019216)代谢显著影响的基因。一个表显示地塞米松处理的OA软骨细胞(D)与对照组(Co)中调节碳水化合物和脂质代谢的基因表达。b而且c热图显示在地塞米松处理的OA细胞(D)和对照组(Co)中分别参与碳水化合物和脂质代谢的差异表达基因的表达。表达式值是deseq2规范化和行缩放,蓝色表示较低的表达式,红色表示较高的表达式

与以往的GWAS和GWEA研究相结合

GWAS研究中先前与OA相关的53个基因[232425]的研究结果显示,其中12例被地塞米松显著影响,其FC值大于2.0(表S5).其中11种(包括COL11A1、COX-2、GDF5、IL6和VEGFA)表达下调,只有一种(IL16)表达上调。

Ramos等人基于微阵列的GWEA研究[9]鉴定出18个基因在同一关节退化和保存的OA软骨中表达差异,其中两个基因受到我们数据中的地塞米松的影响(表S6).其中COL9A1在降解软骨中表达较低,地塞米松也下调了该基因的表达。反过来,神经生长因子(NGF)在退化的软骨中表达水平较高,并被地塞米松强烈下调。

阿尔梅达等人[10]用NGS分析了退化和保留的OA软骨的基因表达。在他们的数据中,有372个基因在FC > 2.0向两个方向的差异表达,其中78个基因在本研究中受到地塞米松(FC > 2.0向两个方向的差异表达)的显著影响。其中,降解软骨与保留软骨相比,有19个表达上调,经地塞米松处理后表达上调,25个表达上调,经地塞米松处理后表达下调。其中17种在降解软骨和地塞米松作用下表达下调,另有17种在降解软骨下调和地塞米松作用下表达上调。有趣的是,NGF是在退化的OA软骨中表达增强并被地塞米松正常化的基因之一(表S7).

差异表达基因之间的相互作用

在受地塞米松影响最强烈的基因中(FC > 5.0),使用STRING数据库确定了几种相互作用(图。2).磷脂酰肌醇3激酶调节亚基α (PI3KR1)、血管细胞粘附蛋白1 (VCAM1)、KIT原癌基因受体酪氨酸激酶(KIT)、FGR原癌基因Src家族酪氨酸激酶(FGR)、C-C基基配体2 (CCL2)和神经生长因子(NGF)在相互作用网络中占据中心位置。

图2
图2

由STRING确定的FC值为5.0或更高的地塞米松上调或下调的基因之间的相互作用。没有相互作用的基因被排除在图之外。边缘的颜色如下:绿色=激活,蓝色=结合,黑色=化学反应,红色=抑制,紫色=催化,粉色=翻译后修饰,黄色=转录调节,灰色=其他相互作用

讨论

骨性关节炎的病理特征是最终的软骨退化,这是由软骨中的基因表达谱不平衡引起的。用于OA治疗的GCs对这一平衡的影响是有趣的,RNA-Seq提供了组织中基因表达的全面视图。发现地塞米松可影响OA软骨细胞中大量基因的表达。在受影响最强烈的基因中,有几个涉及炎症、细胞外基质组织、碳水化合物和脂质代谢。

持续的低级别关节炎症和炎症加重是骨性关节炎的一个主要特征。糖皮质激素被发现可以抑制炎症,这可能部分解释了它们对OA恶化的治疗效果。在我们的数据中,地塞米松降低了众所周知的炎症因子如环氧合酶-2 (COX-2)的表达[38]、白介素6 (IL6)和C-C基序趋化因子配体2 (CCL2) [39].此外,地塞米松下调了软骨细胞外基质降解基质金属蛋白酶(MMPs) 1、13和16的表达,而各种胶原蛋白和合成代谢因子(包括透明质酸合成酶2 [HAS2],这是下调最强烈的基因之一)的表达也下调了。由于骨性关节炎过程中软骨中分解代谢和合成代谢因子的相对表达不同,糖皮质激素对软骨内稳态的影响可能取决于疾病过程的阶段。

据报道,骨关节炎和糖皮质激素治疗与氧化应激增加和软骨细胞凋亡有关[18].激活ROS/Akt/FOXO3信号通路似乎可以抵消这些影响,特别是叉头盒O3 (FOXO3)已被证明可以保护软骨细胞不发生凋亡[40].有趣的是,在目前的数据中,地塞米松强烈上调了FOXO3的表达。超氧化物歧化酶2 (SOD2)使超氧化物阴离子失活,减少氧化应激[21].SOD2在OA软骨中高度表达,经地塞米松处理后表达量增加近三倍。另一方面,地塞米松可强烈增强KLF9的表达,而KLF9已被证明可使细胞对氧化应激敏感[41]并可能有助于先前报道的地塞米松诱导的氧化应激[18].

骨关节炎的疼痛是通过各种细胞内通路和可溶性因子介导的,其中神经生长因子(NGF)被认为是特别重要的[42].靶向NGF的抗体已被证明对治疗骨关节炎疼痛有效,但也可能加速一小部分患者的关节破坏[36].在目前的数据中,地塞米松降低了NGF的表达,这表明关节内GC注射至少可以通过减少NGF的合成部分地缓解OA疼痛。NGF阻滞剂诱导的关节退化机制仍不清楚。有推测认为,由于止痛作用,oa影响的关节使用增加,可以解释这一发现。然而,在非骨关节炎影响的(最初无痛的)关节中也观察到加速降解,这对这一假设提出了质疑[36].gc诱导的NGF下调是否可能有类似的有害影响仍有待研究。除了NGF外,地塞米松治疗也下调了产生前列腺素的COX-2和血管内皮生长因子A (VEGFA)的表达。前列腺素,尤其是铂族元素2,以及VEGFA参与调节OA疼痛[43].因此,地塞米松对糖皮质激素的下调可能有助于糖皮质激素在OA中的镇痛作用。

地塞米松显著影响糖脂代谢相关基因的表达。一个有趣的例子是丙酮酸脱氢酶激酶4 (PDK4),它是地塞米松最强烈上调的基因之一。由于该基因使丙酮酸脱氢酶失活,并阻止糖酵解过程中产生的丙酮酸进行氧化磷酸化[44],这种糖皮质激素效应可能使碳水化合物代谢从线粒体呼吸转向糖酵解。促进脂质合成和运输的若干基因,如磷脂周围素2 (PLIN2) [45和5 ' - amp激活蛋白激酶亚基γ -2 (PRKAG2) [46],也被上调。然而,参与碳水化合物和脂类代谢主要途径(糖酵解、氧化磷酸化、脂解和β -氧化)的酶的基因编码没有受到显著影响。在与oa相关的脂质代谢基因中,载脂蛋白D (APOD)是类固醇和脂蛋白代谢的中心介质。其表达在OA软骨细胞中已被证实减少[47],本研究发现地塞米松可上调APOD。Sestrin 3 (SESN3)在OA软骨中高度表达,被地塞米松上调,参与碳水化合物和脂类代谢的调节。Sestrin信号通路的损伤与OA的发病机制有关[48].这些是地塞米松诱导OA软骨细胞脂质代谢相关基因表达正常化的例子。此外,同样被地塞米松上调的过氧化物酶体增殖物激活受体γ (PPARG)被广泛认为是一种抗炎和软骨保护因子[49除了在细胞代谢中发挥重要作用外。

骨关节炎有很大的遗传成分,因为高达50%的疾病发病率被认为是由遗传学解释的[5051].一些全基因组关联(GWAS)研究已经对OA进行了研究[232425,确定了至少53个与该疾病相关的基因。许多已确认的基因影响细胞外基质合成和骨骼系统发育,而其中一些基因的作用在很大程度上尚不清楚[232425].GWAS研究研究系统性基因组变异,而表达分析(如目前的研究)直接测量感兴趣组织中的基因表达。然而,由于基因多态性往往会影响基因编码的蛋白质的功能或活性,因此可以推测,oa相关基因的表达或活性的改变可能会影响疾病的发展,并可作为治疗靶点。在GWAS研究中发现的53个与髋关节和/或膝关节骨性关节炎相关的基因中,有12个明显受地塞米松影响(FC > 2.0)。例如COL11A1, COX-2, GDF5, IL6和VEGFA,所有这些都被下调了。我们的研究通过地塞米松确定了数百个不同的基因,这使得它们中的一些很有可能碰巧在那些与OA有关的基因中。然而,在那些与OA发展有相对完善的机制联系的基因的情况下,我们认为强调它们作为潜在中介糖皮质激素对疾病发展或症状的影响的基因是合理的。例如,GDF5可能影响软骨的重塑和修复[52], COX-2和IL6可促进OA炎症[39], vegf诱导的血管生成似乎在OA进展和疼痛中发挥作用[42].进一步阐明这些基因在骨关节炎病理生理中的糖皮质激素调节作用可能是一个有趣的进一步研究的途径。

Ramos等人基于微阵列的全基因组表达分析(GWEA)研究[9]之前比较了同一关节中受OA影响的软骨和保留的软骨中的基因表达。它确定了18个差异表达基因,它们的上调或下调可能因此影响OA的发病机制。其中两种,即NGF和胶原9 α 1 (COL9A1),在本研究中受到地塞米松的显著影响。在影响更严重的OA软骨中NGF上调[9],在本研究中发现地塞米松可下调其水平。如前所述,NGF的下调可能会缓解骨性关节炎疼痛,但也会使软骨加速破坏[36].严重受损的OA软骨COL9A1下调[9],在我们的数据中,地塞米松进一步下调了其表达。这可以被认为是一种对OA有影响的抗合成代谢作用,COL9A1缺失在小鼠中诱导骨关节炎样病理的发现进一步支持了这一点[53].我们的研究结果还与最近一项基于扩展研究人群的更大的、基于ngs的表达分析进行了比较[10].在该研究中发现的372个基因在退化和保存的OA软骨中表达显著差异(FC > 2.0),其中78个在我们的研究中受到地塞米松的显著影响。虽然42个基因的表达被地塞米松“正常化”(即,它们的表达向保留软骨的方向改变),但几乎相同数量的基因(34个)向相反的方向改变。因此,虽然糖皮质激素可能部分正常化OA软骨细胞的表型,但这可能通过增加OA软骨中驱动疾病过程的基因表达来抵消。

糖皮质激素作用的时间过程是评估其对软骨的潜在影响时需要考虑的一个重要因素。当以临床相关剂量(1-3毫克)使用时,关节内注射的地塞米松似乎在24小时内大部分从关节吸收[54].因此,我们提出,目前研究中使用的时间点(24小时)有望相当好地捕捉糖皮质激素对OA软骨细胞基因表达的影响,而对蛋白质生成的影响已知会发生并持续较长时间框架(几天)[55].研究糖皮质激素治疗后软骨细胞基因表达的时间演化(包括直接和次生效应)将是进一步研究的有趣途径。

结论

总之,地塞米松被发现引起OA软骨细胞的主要表型转换,而在GWAS和GWEA研究中对OA相关基因的总体影响似乎不大。除了明确的抗炎、抗代谢和细胞外基质靶向作用外,研究发现地塞米松影响脂质和葡萄糖代谢相关基因,这一观察结果可能对OA的代谢表型特别重要。

数据和材料的可用性

所有受地塞米松显著影响的基因列表见补充数据(表S2)。

缩写

ECM:

细胞外基质

ELISA:

酶联免疫吸附试验

舰队指挥官:

褶皱变化

罗斯福:

错误发现率

GC:

糖皮质激素

走:

基因本体论

GWEA:

全基因组表达分析

GWAS:

全基因组关联研究

MMP的:

基质金属蛋白酶

信使rna:

信使核糖核酸

门店:

新一代测序

办公自动化:

骨关节炎

RNA-Seq:

RNA序列

rt - pcr:

实时定量聚合酶链反应

扫描电镜:

均值的标准误差

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下载参考

确认

我们要感谢研究协调员Heli Kupari对软骨样本的娴熟协助,感谢Meiju Kukkonen和Salla Hietakangas的出色技术协助,感谢Heli Määttä提供的巨大秘书帮助。

资金

该研究得到了芬兰风湿病学会、坦佩雷风湿病基金会、Pirkanmaa医院区竞争性研究基金、保罗基金会和斯堪的纳维亚风湿病研究基金会的资助。资助方在研究设计、数据收集和分析、出版决定或稿件准备方面没有任何作用。

作者信息

作者和联系

作者

贡献

AP参与了研究的概念和设计以及实验室分析;他分析了数据并起草了手稿。TL参与了研究的设计、实验室分析、数据解释和修改手稿。MH参与了研究的设计、实验室分析和修改手稿。TM参与了研究的设计、患者的选择和患者样本的获取、数据的解释以及手稿的修改。KV参与了研究的设计、数据的解释和手稿的修改。EM监督了这项研究,特别是参与了研究的概念和设计,在数据的解释和撰写手稿。所有作者都认可了手稿的最终版本。

相应的作者

对应到Eeva带

道德声明

伦理批准和同意参与

该研究得到了芬兰坦佩雷大学医院伦理委员会的批准,并根据《赫尔辛基宣言》进行。所有患者均获得书面知情同意。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

作者声明没有利益冲突。

额外的信息

出版商的注意

卡塔尔世界杯常规比赛时间施普林格自然对出版的地图和机构附属的管辖权要求保持中立。

补充信息

附加文件1:表S1。

用于定量RT-PCR的引物和探针。表S3。地塞米松处理过的OA软骨细胞(D)相对于对照组(Co)软骨成分的表达。表S4。在地塞米松处理的OA软骨细胞(D)中,相对于对照组(Co),选择与炎症、氧化应激、分解代谢和细胞外基质生成相关的基因,通过NGS测定并通过RT-PCR证实。表S5。地塞米松处理的OA软骨细胞(D)相对于对照组(Co)中碳水化合物和脂质代谢主要途径基因的表达[35].表S6。既往GWAS研究中地塞米松对骨关节炎相关基因的影响[212223].表S7。在Ramos等人的GWEA研究中,地塞米松对先前与OA相关基因的影响[9].表S8。在Almeida等人的GWEA研究中,地塞米松对先前与骨关节炎软骨有关的基因的影响。[10].图S1。地塞米松对OA软骨细胞分解代谢和促炎因子产生的影响。将分离自OA患者的OA软骨细胞/软骨细胞分别加入或不加入地塞米松(1 μM)培养24 h。ELISA法测定培养基中MMP-1 (A)、MMP-13 (B)和CCL2 (C)的含量。MMP-1 (D), MMP-13 (E)和CCL2 (F) mRNA表达用定量RT-PCR和GAPDH归一化方法进行研究。结果与对照组进行比较,对照组设置为100%。结果用均值+ SEM表示,n= 9。*:p< 0.05, * *:p< 0.01和***:p< 0.001,与未治疗的对照组相比。

额外的文件2:

表S2。所有基因在地塞米松处理的OA软骨细胞(D)中相对于对照组(Co)表达差异。

权利和权限

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彭马里,A. Leppänen, T. Hämäläinen, M。et al。通过RNA-Seq测定骨关节炎患者软骨细胞中糖皮质激素基因表达的广泛调控。关节炎Res其他22271(2020)。https://doi.org/10.1186/s13075-020-02289-7

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关键字

  • 骨关节炎
  • 软骨
  • 软骨细胞
  • 糖皮质激素
  • RNA-Seq