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IL-23在小鼠关节炎和炎症性疼痛发展中的作用

摘要

背景

白细胞介素-23 (IL-23)是一种细胞因子,它对炎症性疾病(包括关节炎)的发展至关重要,通常与T淋巴细胞生物学有关。我们先前发现,某些淋巴细胞无关的炎症性关节炎和疼痛模型对肿瘤坏死因子(TNF)、粒细胞巨噬细胞集散刺激因子(GM-CSF)和C-C基序配体17 (CCL17)有类似的需求。鉴于细胞因子需求的这种相关性,我们探索了IL-23是否可能与这个细胞因子集群相互作用,以控制关节炎和炎症性疼痛。

方法

通过小鼠关节炎模型(zymosan诱导的关节炎和GM-CSF-, TNF-和CCL17驱动的单关节关节炎)和炎症性疼痛模型(足底内zymosan, GM-CSF, TNF和CCL17)研究IL-23在疼痛样行为发展中的作用。此外,测量il -23诱导的炎性疼痛gm - csf−−/肿瘤坏死因子−−/,Ccl17E / E小鼠和存在消炎痛的小鼠。疼痛样行为和关节炎分别通过后肢和组织学的相对重量分布进行评估。用定量PCR方法分析膝关节和足部皮肤细胞因子mRNA的表达。采用流式细胞术分析血液和滑膜细胞群。

结果

我们的报告,使用Il23p19−−/先天免疫(酶聚糖)驱动的关节炎疼痛样行为(在这里称为疼痛)完全依赖于IL-23;IL-23 (P< 0.05)。酶莫桑诱导的炎症性疼痛也完全依赖于IL-23。此外,我们发现外源性TNF-、GM-CSF-和ccl17驱动的关节炎疼痛,以及由这些细胞因子驱动的炎症性疼痛,在研究中均未出现Il23p19−−/老鼠;在这些mbsa启动的模型中,最佳疾病依赖于IL-23 (P< 0.05)。相反,IL-23 (200ng)可在4 h时诱导炎性疼痛(P< 0.0001),对其他每种细胞因子以及环氧合酶活性都有要求。

结论

这些发现表明IL-23在先天免疫介导的关节炎和炎症性疼痛中的作用,可能与TNF、GM-CSF、CCL17和类二十烷素功能有关。

背景

疼痛是许多肌肉骨骼疾病的重要症状,例如类风湿性关节炎(RA)和银屑病性关节炎(PsA),会导致功能障碍和生活质量低下。促炎细胞因子除了在炎症关节的疾病进展中发挥作用外,还与关节炎疼痛的发展有关,而且通常也与疼痛进展有关[12].例如,抑制肿瘤坏死因子(TNF)的作用[3.4或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) [5改善炎症性关节炎动物模型的关节疼痛,临床上也可用于风湿性关节炎患者[67].我们最近在体外单核/巨噬细胞中描述了一种新的GM-CSF➔CCL17通路,我们发现它在体内不仅对炎性关节炎疼痛和疾病发展很重要[8910],也可治疗骨关节炎疼痛和疾病[10].由于TNF和GM-CSF作用之间的潜在相互依赖性,该途径也可能与TNF生物学有关[9].

细胞因子IL-23和IL-17在炎症动物模型(包括关节炎和一些人类慢性炎症疾病)的发病机制中起着重要作用[1112].IL-23是IL-12家族的成员,由IL-23特异性的p19亚基和与IL-12共享的p40亚基组成[13].已知IL-23可刺激Th17细胞的发育和IL-17的产生[14].IL-23/IL-17轴与自身免疫/炎症疾病的发展有关,如PsA [12].普遍的观点是IL-23与Th细胞生物学密切相关,IL-17受IL-23控制[15161718].然而,临床试验数据表明,它们可以分离,表明更广泛的生物学[11].在临床前模型中,缺乏IL-23p19的小鼠完全免受抗原诱导关节炎(AIA)的影响[19],胶原性关节炎[20.21]和实验性过敏性脑脊髓炎(EAE) [22];IL-23也是诱导包括TNF在内的关节炎症介质所必需的[20.].还有其他证据表明IL-23和TNF的表达可以相互依赖,包括在关节炎患者中[23242526].然而,很少有人知道IL-23在疼痛发展中的作用。

巨噬细胞和树突状细胞(dc)中IL-23和GM-CSF之间的联系已被注意到[27282930.], Th细胞分泌il -23依赖性GM-CSF已被证明在EAE发展中至关重要[1516].有人提出了一种正反馈循环,Th细胞产生的GM-CSF可进一步诱导抗原提呈细胞产生IL-23 [1530.31].在肠道炎症中,这些细胞因子之间存在额外的循环,涉及第3组固有淋巴样细胞(ilc3)和髓样细胞群[3233].

GM-CSF➔CCL17通路,以及其与TNF的潜在联系,可以调节淋巴细胞独立模型中的疼痛和关节炎疾病[89].根据上述背景数据,我们决定探索炎症和关节炎疼痛领域是否可能存在一种新的IL-23生物学,它可能与GM-CSF、TNF和CCL17的作用有关,而不一定涉及T淋巴细胞。在目前的研究中,使用最多Il23p19不足(Il23p19−−/)小鼠,我们证明与TNF、GM-CSF和CCL17相似,IL-23也是酶沙诱导关节炎(ZIA)及其相关炎症性疼痛行为(在此称为疼痛)的发展所必需的。我们还表明,IL-23是GM-CSF-、TNF-和ccl17驱动的关节炎疼痛和疾病所必需的,以及由足底内(i.pl)给药这些细胞因子引起的疼痛。此外,我们发现IL-23本身可以诱导炎症性疼痛,而炎症性疼痛又依赖于这些细胞因子和环氧合酶活性。

方法

老鼠

实验使用了以下小鼠:gm - csf (Csf2)−−/(路德维希癌症研究所)[34),肿瘤坏死因子−−/(Walter and Eliza Hall Institute (WEHI),澳大利亚帕克维尔)[35),Ccl17E / E(其中Ccl17已被增强型绿色荧光蛋白(EGFP)所取代(来自I. Förster) [36),而Il23p19−−/老鼠(来自M.史密斯)[37].所有基因缺陷小鼠回交到C57BL/6背景(WEHI)上超过10代。本研究共使用了408只小鼠。小鼠被随意喂食标准啮齿类食物和水。使用性别和年龄匹配的小鼠;实验得到了墨尔本大学动物伦理委员会和GSK动物护理、福利和治疗政策的批准。

Zymosan-induced关节炎模型

用于诱导酶沙诱导关节炎(ZIA)模型[893839],小鼠左膝关节注射300 μg,体积为10 μl的超声化酶沙(Sigma-Aldrich),对侧膝关节注射生理盐水作为对照。第7天收集关节进行基因表达和组织学分析。

炎性疼痛模型

经足底内(i.pl.)注射(10 μl) zymosan (100 μg, Sigma-Aldrich)、小鼠TNF (20 ng, R&D Systems)、小鼠GM-CSF (20 ng, Peprotech)、小鼠CCL17 (50 ng, Biolegend)诱导疼痛[89],小鼠IL-23(50、100和200 ng, R&D系统),或盐水注入左后脚垫。用弹簧卡尺测量足肿胀(Mitutoyo, Tokyo, Japan)。为阻断环氧合酶活性,注射吲哚美辛(12.5 μg/爪)t= 0。

mBSA-induced关节炎模型

诱发的单关节关节炎与以前一样[5840第0天右膝关节内(i.a)注射100 μg mBSA和10 μl生理盐水,左膝注射生理盐水,然后在第0 - 2天在颈背处注射s.c.,小鼠GM-CSF (500 ng, R&D Systems)、小鼠TNF (500 ng, R&D Systems)、小鼠CCL17 (600 ng, R&D Systems)或生理盐水。处死小鼠(第7天),收集膝关节进行组织学检查[89].

单克隆抗体(mAb)给药时,小鼠给予150 μg抗il -23p19 (G23-8, ebioscience™)或同型(IgG1)对照。预防给药时,小鼠分别于−2天和0天腹腔注射mAb;对于单克隆抗体的治疗性给药,小鼠在疼痛明显后(即mBSA/TNF和mBSA/GM-CSF模型分别为第1天和第4天)进行ip注射。

疼痛样行为不电容计的评估

作为疼痛样行为的一个指标,使用不电容计(IITC生命科学公司,美国)测量了3 s内炎症后肢相对于非炎症后肢之间的重量差异分布。该技术已被验证用于测量关节炎膝关节和脚垫疼痛[89103841].在实验开始前,小鼠至少三次适应不电容计。对每个时间点进行三次测量并取平均值。

重量分布值以左后肢相对于对侧后肢的相对压力计算,用百分数表示,公式为:

$ $ \三角洲\ mathrm {W} = \压裂{\ mathrm{王}}{\ mathrm {wR}} \乘以100 \ % $ $

其中wL和wR分别为左后肢和右后肢的压力读数。

组织学

终止时,膝关节切除、固定、脱钙、包埋石蜡[5842].正面切片(7 μm)用H&E染色对于ZIA,细胞浸润、蛋白多糖丢失(Safranin O/Fast Green染色)和骨侵蚀分别从0(正常)到3(严重)进行评分[839].对于mBSA/TNF、mBSA/GM-CSF和mBSA/CCL17模型,细胞浸润、滑膜炎(滑膜增生)、滑膜翳形成、软骨损伤和骨侵蚀分别从0(正常)到5(严重)进行评分,如前所述[5843].简单地说,评估髌下脂肪垫、关节囊和骨膜鞘邻近区域的软组织炎症,根据细胞浸润和血管生成的程度进行分级。滑膜炎(滑膜增生)被定义为滑膜增生,但不包括滑膜翳的形成。泛膜被定义为肥厚的滑膜组织与关节表面形成紧密连接。软骨和骨损伤的评估是基于软骨基质的损失,软骨表面的破坏和损失,软骨下骨侵蚀的程度和深度。组织学总分计算为总分的总和,总分为25分。评分是由两名独立的研究人员盲目完成的,并进行了一致性比较。所显示的结果来自一位研究人员。

定量聚合酶链反应

qPCR实验如前所述进行[891038].简单地说,使用isolation II RNA Mini Kit (Bioline, Taunton, MA)提取总RNA,并使用Tetro逆转录酶(Bioline, Taunton, MA)进行逆转录。定量PCR使用QuantStudio™5 (Applied Biosystems™,Carlsbad, CA)和预先开发的小鼠TaqMan探针/引物组合进行Il23p19肿瘤坏死因子Csf2Ccl17,哥伦比亚大学(技术)。所有样品均重复检测。将阈值周期数转换为ΔCt值,并将结果相对于参考基因表达,哥伦比亚大学891038

细胞群分析

如前所述,采集血液和关节细胞[103844],然后用流式细胞术进行分析。简单地说,用正常小鼠血清(1/4稀释)阻断细胞上的Fc受体,并用荧光标记单抗对小鼠CD45-PerCP(克隆30-F11)、CD115-APC(克隆AFS98)、CD11b-APC-Cy7(克隆M1/70)、Ly6G-PE-Cy7(克隆1A8)、F4/80-BV421(克隆BM8)和相应的同型对照进行染色,这些同型对照来自BD Biosciences、Biolegend或eBiosciences。细胞分析使用CytoFLEX LX分析仪(Beckman Coulter)。

统计数据

对于疼痛读数和基因表达,采用双向方差分析;组织学评分采用Mann-Whitney双样本秩检验和双向方差分析。对于人口分析,学生的t测试使用(GraphPad Software,版本5.04,圣地亚哥,加州)。适当时使用Bonferroni事后检验。数据汇集自两个实验。数据以均数±SEM表示,具有显著性P值表示。一个P值小于0.05被认为是显著的。

结果

IL-23是酶沙诱导的关节炎疼痛和最佳疾病发展以及酶沙诱导的炎症性疼痛所必需的

关节炎

IL-23在适应性免疫驱动关节炎模型的疾病进展中发挥作用,例如,AIA [19]和中央情报局的模特[20.21].我们在先天免疫驱动模型中检查了它是否对关节炎疼痛和疾病发展也很重要。由关节内注射zymosan诱导的ZIA是一种广泛使用的巨噬细胞依赖性[45],单关节关节炎模型;我们此前曾报道,在该模型中,疼痛和最佳关节炎发展需要内源性GM-CSF、TNF和CCL17 [89].注射i.a. zymosan后,WT小鼠通过改变体重分布(电容计)产生了疼痛样行为(此处称为疼痛)(见“方法章节),直到第5天[38].相比之下,Il23p19−−/小鼠则没有。1a),表明IL-23依赖。组织学检查Il23p19−−/通过细胞浸润评估,小鼠发生的ZIA明显少于WT小鼠(P= 0.04, 95%可信区间(CI) 0.032, 1.746)和骨侵蚀(P= 0.0008, 95% CI 0.504, 2.218)(图1b)。

图1
图1

IL-23是酶沙诱导的关节炎疼痛和最佳疾病发展以及酶沙诱导的炎症性疼痛所必需的。一个bWT和Il23p19−−/小鼠接受关节内注射zymosan。一个疼痛(不电容计[注射后肢负重相对于未注射后肢负重的比值];值小于100表示疼痛)和b测量关节炎(组织学:H&E染色,Safranin O/Fast Green染色,第7天)。箭头分别表示以下特征:固体箭头,细胞浸润;虚线箭头,骨蚀;虚线箭头表示蛋白多糖损失。cdWT和Il23p19−−/小鼠接受足底内注射zymosan。c爪肿胀(× 10−2毫米)和d疼痛(电容测量仪)在6小时内测量。数据以平均值±SEM表示;一个- - - - - -dWT和Il23p19−−/雄性老鼠(生理盐水,n= 10;酵母聚糖,n= 10)。在统计分析中,使用了疼痛的双向方差分析和组织学的Mann-Whitney检验。*P< 0.05, * *P< 0.01, * * *P< 0.01, * * * *P< 0.0001, WT vs。Il23p19−−/老鼠

相似的ZIA数据Il23p19−−/小鼠和GM-CSF、TNF和CCL17基因缺陷小鼠[89]表明IL-23的功能可能与该模型中的每一种细胞因子有关。为了开始检查这些可能性,在ZIA关节中使用WT和测量IL-23对其他细胞因子基因表达的依赖性Il23p19−−/老鼠。可以看到酶促的mRNA水平(第7天)Csf2(GM-CSF基因)和Ccl17,但不是为了肿瘤坏死因子,证明IL-23依赖(附加文件1:图S1A);相反,zymosan-stimulatedIl23p19关节内mRNA表达减少gm - csf−−/而且肿瘤坏死因子−−/老鼠,但不在里面Ccl17E / E小鼠,当与WT小鼠的值比较时(附加文件1:图S1B),表明依赖于前两种细胞因子(见“讨论”一节)。

炎症性疼痛

足底内给药zymosan是一种研究充分的炎症性疼痛模型[89384647].我们测试了该模型是否也需要IL-23。术后4和6小时。zymosan,爪肿胀(厚度增加)在WT和Il23p19−−/老鼠(图。1c);然而,相比之下,疼痛只在WT小鼠中明显。1d),再次表明IL-23依赖。

这些数据表明,IL-23是酶沙诱导的关节炎和炎症性疼痛以及酶沙诱导的最佳关节炎发展所必需的。

IL-23是GM-CSF-、TNF-和ccl17驱动的关节炎疼痛和疾病发展所必需的

为了进一步探索IL-23是否可能与GM-CSF、TNF和/或CCL17在关节炎疼痛和疾病的控制中相关,我们再次使用了由这些细胞因子以淋巴细胞独立的方式单独驱动的关节炎模型[589] -这些其他的单关节关节炎模型都涉及到给具有甲基化BSA (mBSA)“启动”关节的小鼠系统性给药细胞因子,这是一种探索特定细胞因子潜在下游途径的方便方法[89].这些模型如下:gm - csf驱动(即mBSA第0天,皮下(s.c.))GM-CSF第0-2天,[5),肿瘤坏死因子驱动(即mBSA第0天,s.c TNF第0 - 2天,[9)和CCL17驱动(即mBSA第0天,s.c. CCL17第0 - 2天,[8])关节炎。然而,应该注意的是,给药外源性系统性细胞因子不一定能说明内源性分子的作用[484950].

诱导mBSA/GM-CSF后(图。2a)和mBSA/TNF(图。2b) WT小鼠出现关节炎,如预期的那样,第4天出现疼痛(P= 0.0081, 95% CI−21.93,−1.782)和1 (P= 0.0007, 95% CI 26.97−−5.902),分别为(59],这在生理盐水对照组中未见;然而,未见关节炎疼痛Il23p19−−/这两种模型中的任何一种小鼠(图。2a, b),表明IL-23依赖。组织学检查Il23p19−−/小鼠也不受GM-CSF- (P= 0.0004, 95% CI 1.094, 3.656)和tnf驱动(P= 0.001, 95% CI 1.116, 4.384)2a, b).我们之前已经证明,在整个mBSA/TNF关节炎模型中都需要GM-CSF,而TNF仅在mBSA/GM-CSF模型的早期启动阶段需要[9].为了确定在这些模型中何时需要IL-23,我们再次使用抗il -23p19单抗或同型对照的单抗方法,无论是预防(−2天和0天)或治疗(当疼痛明显时- mBSA/GM-CSF,第4天;预防性给予抗il -23p19单抗后,GM-CSF和TNF驱动的关节炎疼痛发展被阻止(图1)。3.分别为a, b);预防性抗il -23p19单抗也减少了两种模型(gm - csf驱动模型,P= 0.0159;TNF-driven模型,P= 0.0317)(图3.a, b)。另一方面,治疗性抗il -23p19单抗治疗无法改善GM-CSF和tnf驱动的关节炎疼痛或疾病(图。3.c, d)。

图2
图2

IL-23是GM-CSF和tnf驱动的关节炎疼痛和疾病发展所必需的。一个mBSA/GM-CSF关节炎(mBSA关节内(i.a.)[第0天];GM-CSF或皮下盐水(s.c.)[0-2天])和bmBSA/TNF关节炎(mBSA i.a.[第0天];肿瘤坏死因子或生理盐水[0-2天])在WT和Il23p19−−/老鼠。测量疼痛(不电容计)和关节炎(组织学,第7天)。数据以平均值±SEM表示;一个bWT和Il23p19−−/雄性老鼠(mBSA /生理盐水,n= 6;mBSA / gm - csf和mBSA /肿瘤坏死因子,n= 8)。统计分析采用双向方差分析。P< 0.05,# #P< 0.01,# # #P< 0.001, WT盐水vs WT GM-CSF或TNF。*P< 0.05, * *P< 0.01, * * *P< 0.001, * * * *P< 0.0001, WT GM-CSF或TNF vs。Il23p19−−/gm - csf或肿瘤坏死因子

图3
图3

IL-23是GM-CSF和tnf驱动的关节炎疼痛和疾病发展所必需的。mBSA/GM-CSF (mBSA关节内(内)[第0天];GM-CSF或皮下盐水(s.c.)[第0 - 2天])和mBSA/TNF (mBSA i.a.[第0天];在WT小鼠中诱导TNF或生理盐水s.c.[0-2天]关节炎。小鼠采用抗il -23p19单抗或IgG1同型对照一个b预防性(150 μg, days - 2和0)或cdmBSA/GM-CSF和mBSA/TNF治疗(150 μg,第4天或第1天)。评估疼痛(不电容计)和关节炎(组织学,第7天)。数据以平均值±SEM表示;一个cWT mBSA/GM-CSF雄性小鼠(IgG1同型对照,n= 5;anti-IL-23p19马伯,n= 5),bdWT mBSA/TNF雄性小鼠(IgG1同型对照,n= 5;anti-IL-23p19马伯,n= 5)。统计分析采用双向方差分析。*P< 0.05, * *P< 0.01, * * *P< 0.001,与抗il -23p19单抗同型

鉴于在这两种细胞因子驱动的关节炎模型中,关节炎关节都注射了mBSA,而IL-23的需求似乎处于起始阶段,我们认为这个时间可能与发生在mBSA“启动”关节中IL-23依赖的细胞群变化有关,在系统性细胞因子给药之前,即IL-23可能实际上并不是外源性细胞因子作用的下游。为了开始测试这个建议,滑膜巨噬细胞(CD45+CD11b+F4/80+Ly6G)和中性粒细胞(CD45+CD11b+Ly6G+)的数量(流式细胞术)分析naïve和注射mbsa的WT和Il23p19−−/老鼠(附加文件2:图S2A)。而在naïve关节的细胞数量没有明显的差异(附加文件2:图S2B)中,巨噬细胞明显减少,而中性粒细胞则没有Il23p19−−/注射内注射mBSA后1天,与WT关节比较2:图S2C)。与关节的这些发现一致的是,稳定状态的血液单核细胞(CD11b+CD115+)出现在Il23p19−−/与WT小鼠相比,血清中性粒细胞(CD11b+Ly6G+CD115)(额外的文件2:图S2D-E)。WT和msa“启动”关节中巨噬细胞数量的差异Il23p19−−/因此,小鼠可能是引起疼痛和关节炎(主要是滑膜炎)差异的原因之一。2a、b)。

对于WT小鼠的mBSA/CCL17关节炎,如预期的那样,疼痛在第6天出现[8].尽管本模型不需要TNF和GM-CSF [9有趣的是,关节炎疼痛再次没有出现Il23p19−−/老鼠(图。4);衡量组织学检查Il23p19−−/小鼠也不受ccl17驱动的关节炎的影响(P= 0.0002, 95% ci 1.501, 5.332)。

图4
图4

IL-23是ccl17驱动的关节炎疼痛和疾病发展所必需的。mBSA/CCL17关节炎(mBSA i.a.[第0天];CCL17或生理盐水s.c.[0-2天])在WT和Il23p19−−/老鼠。测量疼痛(不电容计)和关节炎(组织学,第7天)。数据以平均值±SEM表示;WT雌性小鼠(mBSA/生理盐水,n= 8;mBSA / CCL17,n= 8),Il23p19−−/雌性老鼠(mBSA /生理盐水,n= 8;mBSA / CCL17,n= 9)。统计分析采用双向方差分析。# #P< 0.01,# # #P< 0.001, WT盐水vs WT CCL17。***P< 0.001, WT CCL17 vs。Il23p19−−/CCL17

总的来说,这些数据表明IL-23在GM-CSF-、TNF-和ccl17诱导的关节炎疼痛和疾病发展中以某种方式是必需的。

GM-CSF-、TNF-和ccl17驱动的炎性疼痛需要IL-23

接下来,我们探索了IL-23参与GM-CSF-、TNF-和ccl17驱动的急性炎性疼痛模型[589] -我们之前已经使用这些模型来探索这些各自的细胞因子是如何引发炎性疼痛的,以及它们在这一背景下是如何联系在一起的[589].像以前一样(589,在特定剂量下,WT小鼠注射i.p.l。gm - csf(无花果。5)、肿瘤坏死因子(无花果。5b)和CCL17(图。5C)在4小时左右出现疼痛(P< 0.0001, WT盐水vs WT GM-CSF), 2 h (P= 0.0078, WT盐水vs WT TNF), 6 h (P= 0.0058, WT盐水vs WT CCL17)注射后。至于相应的细胞因子驱动的关节炎疼痛模型(图5。2而且4),Il23p19−−/在这些炎症性疼痛模型中,小鼠被保护不受疼痛发展的影响。5a-c),再次表明IL-23依赖。

图5
图5

GM-CSF-、TNF-和ccl17驱动的炎性疼痛需要IL-23。WT和Il23p19−−/小鼠接受足底内(i.pl)注射生理盐水,一个gm - csf,b肿瘤坏死因子,或cCCL17。测量疼痛(电容计)。数据以平均值±SEM表示;一个- - - - - -cWT雄性小鼠(生理盐水;n= 8;gm - csf / TNF / CCL17,n= 10),Il23p19−−/雄性老鼠(gm - csf /肿瘤坏死因子,n= 10;CCL17,n= 15)。统计分析采用双向方差分析。# #P< 0.01,# # # #P< 0.0001, WT盐水vs WT GM-CSF, TNF或CCL17。*P< 0.05, * *P< 0.01, * * *P< 0.001, WT GM-CSF, TNF或CCL17 vs。Il23p19−−/分别是GM-CSF, TNF或CCL17

这些数据表明,IL-23也是小鼠爪中由这些细胞因子驱动的炎性疼痛的发展所必需的。

IL-23诱导疼痛需要GM-CSF、TNF、CCL17和环氧合酶活性

IL-23在TNF-、GM-CSF-和ccl17驱动的疼痛中是必需的,我们假设IL-23单独可能足以诱导疼痛,可能还需要其他细胞因子的参与。为了测试这些可能性,WT小鼠接受了增加剂量的i.p.l。IL-23。100ng和200ng,而不是50ng的IL-23在4小时内引起急性疼痛(P= 0.0041,盐水vs. 100 ng;P< 0.0001,盐水vs. 200 ng)(图。6a).为了确定是否需要其他细胞因子,我们注射了IL-23 (200 ng) i.pl。成gm - csf−−/肿瘤坏死因子−−/,Ccl17E / E而WT小鼠表现出疼痛(图。6罪犯),gm - csf−−/(无花果。6b),肿瘤坏死因子−−/(无花果。6c),Ccl17E / E(无花果。6D)老鼠没有。因为已知由i.p.l引起的疼痛。GM-CSF、TNF和CCL17需要环氧合酶(COX)活性才能发育[589],我们下一步确定抑制COX活性是否也会抑制il -23引起的疼痛。用吲哚美辛治疗小鼠可以抑制il -23引起的疼痛。6e),表明COX活性,可能导致一种二十烷类化合物(如PGE)的形成2),是必需的。

图6
图6

IL-23诱导疼痛需要GM-CSF、TNF、CCL17和环氧合酶活性。一个WT小鼠在足底内(i.pl)注射生理盐水或IL-23 (50 ng, 100 ng,或200 ng)。测量疼痛(电容计)。b- - - - - -d一个i.pl。给予生理盐水或IL-23 (200 ng)注射bWT和gm - csf−−/老鼠,cWT和肿瘤坏死因子−−/老鼠,dWT和Ccl17E / E老鼠。测量疼痛。eWT小鼠接受i.p.l。IL-23 (200 ng)加或不加吲哚美辛(12.5 μg/爪i.l l);在t= 0)在第0天。测量疼痛。数据以平均值±SEM表示;一个WT雌性小鼠(生理盐水;n= 5;50 ng,n= 10;100 ng,n= 10;200 ng,n= 15)b- - - - - -dWT,gm - csf−−/肿瘤坏死因子−−/,Ccl17E / E雄性老鼠(生理盐水,n= 6;IL-23,n= 10),eWT雌性小鼠(生理盐水;n= 10;吲哚美辛,n= 10)。统计分析采用双向方差分析。**P< 0.01,生理盐水vs. IL-23 (100 ng)。P< 0.05,# #P< 0.01,# # # #P< 0.0001,盐水vs. IL-23 (200 ng)。^P< 0.05, ^ ^P< 0.01, WT IL-23 vs。gm - csf−−/IL-23,肿瘤坏死因子−−/IL-23或Ccl17E / EIL-23分别;IL-23 +生理盐水vs. IL-23 +消炎痛

总的来说,这些数据表明,外源性IL-23诱导皮肤疼痛的途径需要TNF、GM-CSF、CCL17和COX活性。

讨论

在炎症/自身免疫中,许多IL-23的生物学特性往往与T淋巴细胞的生物学特性相关(例如,[15161718])。以上数据为IL-23参与关节炎和炎症性疼痛的临床前模型提供了第一个证据。应该注意的是,这种累及是独立于淋巴细胞发生的,因为所研究的关节炎模型不需要淋巴细胞[89].我们之前报道过ZIA疼痛和疾病,以及酶合剂诱导的炎症性疼痛,依赖于GM-CSF、TNF、CCL17和COX活性[89].我们在这里已经表明IL-23也是必需的,这至少表明了一种相关性,但也表明IL-23和这些模型中的这些介质之间可能存在联系。ZIA关节的mRNA表达分析检查IL-23p19的依赖性和表达,表明与TNF、GM-CSF和/或CCL17的表达有联系1:图S1),它们本身又在这个模型中被连接起来[89].然而,如果要进一步阐明这些可能的联系,还需要更多的信息,例如,研究基因缺陷小鼠菌株的炎症ZIA关节的细胞数量和特定细胞表达。

我们还证明,至少通过使用包含外源性细胞因子的模型并再次不需要淋巴细胞的方法,TNF-和gm - csf除了相互需要之外,还会导致关节炎疼痛和疾病[89,也需要IL-23。换句话说,通过这种方法,IL-23、TNF和GM-CSF的作用可以整合到关节炎疼痛和疾病的控制中,即使没有淋巴细胞的参与。为了支持这些观察结果,有报道称,在小鼠和关节炎患者体内,IL-23和TNF生物学的至少某些方面存在关联[22232425265152];IL-23和GM-CSF在小鼠体内的表达水平以及炎症/自身免疫性疾病的适应性和先天免疫模型的相互控制中也存在关联[151630.31323353545556].

我们此前发现,CCL17也可能是TNF-和gm - csf驱动的关节炎疼痛和疾病进展的关键下游中介因子[89].然而,ccl17驱动的关节炎疼痛和疾病,一个不需要淋巴细胞的模型[8,不需要TNF或GM-CSF [89有趣的是,与之相反,我们发现在mBSA“启动”关节中这些ccl17驱动的反应需要IL-23。因此,至少对于细胞因子驱动的关节炎模型,以及如前所述的ZIA模型,IL-23可以与其他三种细胞因子结合。可能的机制相关性是,除了最初定义为T细胞运输的趋化因子外,CCL17通过其受体CCR4参与了DC的迁移和功能[575859],包括通过gm - csf依赖通路调控IL-23的形成[5758].

尽管mBSA/细胞因子模型很方便,能够潜在地识别细胞因子的镇痛和致关节炎作用的候选下游介质,但应该记住,它们是两个阶段的模型,涉及到细胞因子进入mBSA“启动”关节的系统给药。正如我们在附加文件中的数据所暗示的那样,mBSA“启动”阶段可能有助于后续的细胞因子效应1:图S2,其中组织巨噬细胞数量的减少可能与中所述的较低组织炎症反应有关Il23p19−−/而这反过来可能是由于它们的稳态血单核细胞数量减少,正如前面在细菌感染模型中所示[60].

IL-23先前已被发现在临床前关节炎模型中对疾病进展很重要。在AIA中,最佳疾病的发展需要IL-23 [19];中央情报局,Il23p19−−/小鼠完全免受关节炎的影响,但与我们上述mBSA/GM-CSF和mBSA/TNF模型的研究结果相似,mAb对发病后IL-23的抑制无效[20.21].然而,AIA和CIA模型都与适应性免疫反应相关[6162],但有趣的是,在我们上述发现的背景下,它们也依赖于TNF和GM-CSF [41636465],而且AIA模型依赖于CCL17 [8].我们之前检查了ZIA关节的细胞组成(第7天),显示明显的巨噬细胞和中性粒细胞浸润[38].研究表明IL-23参与炎性巨噬细胞数量的调节[60,如前所述,以及中性粒细胞[236667],而在AIA中,IL-23以前列腺素依赖的方式驱动中性粒细胞迁移到滑膜腔[66].IL-23的生物学也与粒细胞- csf (G-CSF)的生物学有关[68],后者有助于增加中性粒细胞数量,并在炎症中发挥作用,包括在ZIA疼痛和疾病发展中[38].因此,上面所见的细胞浸润减少Il23p19−−/上述研究的关节炎模型小鼠可能是由于il -23诱导的单核细胞和中性粒细胞迁移受损[6066,进而影响疼痛程度和关节结构的改变。我们还发现上述雄性和雌性小鼠的关节炎数据相似。我们承认,虽然测量后肢重量分布的相对变化作为关节炎疼痛的指标是一种高度相关和完善的方法[5891038,它并没有完全捕捉到疼痛的表现型。

最近,在小鼠中发现了一种新的IL-12家族成员,即IL-39,这是一种异二聚体,由IL-23p19(与IL-23共享)和EBI3(与IL-27和IL-35共享)组成[6970].尽管IL-39存在于人体内的证据仍存在争议[71],可能与我们的研究相关,有报道称小鼠IL-39可以激活中性粒细胞并介导小鼠狼疮样疾病的炎症[6970].IL-39是否有助于我们的上述发现尚不清楚。

我们还证明,IL-23本身可以引起爪子疼痛,这依赖于其他细胞因子,与炎症关节中注意到的联系一致。可能与这些观察结果相关的是,IL-23和CCL17可以诱导皮肤炎症,前者通过TNF [2472],两者在临床上均与银屑病和特应性皮炎有关[7374].IL-23和其他三种细胞因子之间的另一个联系似乎是,IL-23诱导的炎症性疼痛依赖于COX活性,很可能是COX-2活性,因为COX-2抑制剂抑制了TNF、GM-CSF和CCL17引起的炎症性疼痛[89].cox -2衍生产品,如PGE2,在体内和体外均与IL-23的形成和功能广泛相关[667576777879].除了PGE2研究还表明,伤害感神经元产生的CGRP可通过皮肤树突状细胞诱导IL-23的形成[67].这一发现表明细胞因子的产生可能不是一个简单的线性序列,而是多个中介环的作用,如前所强调的[9].

结论

我们先前已经注意到GM-CSF➔CCL17通路在调节实验性关节炎和炎症性疼痛中的重要作用,该通路也可能与TNF和类二十烷素的作用有关[89].重要的是,GM-CSF➔CCL17通路似乎在RA患者中很活跃[80].有趣的是,我们现在提供的证据表明,IL-23也应该被认为可能与这一途径有关,并可以在某些病理中表现出淋巴细胞独立生物学。关于IL-23参与疼痛进展的文献证据有限[81尽管抗il -23p19单抗可以减轻PsA患者的疼痛[82].可能与我们在爪子中发现的IL-23相关的是,有报道称,伤害感觉神经元驱动IL-23介导的银屑病样皮肤炎症[67].根据我们以上的数据,似乎有必要进一步研究IL-23在疼痛调节中的作用。

数据和材料的可用性

不适用

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下载参考

确认

我们感谢墨尔本脑中心Parkville流式细胞仪设备的成员对流式细胞仪的协助。

资金

a . Cook和J.A. Hamilton获得了一笔赠款(1085240)的支持,J.A. Hamilton获得了澳大利亚国家卫生和医学研究委员会(NHMRC)的高级主要研究奖学金。库克和汉密尔顿的部分资助来自葛兰素史克。

作者信息

作者和联系

作者

贡献

MCL、ADC和JAH构思了这项研究。MCL, ZZ, AA, AJF和ADC进行了调查。MCL和ADC进行形式化分析。MCL、ADC和JAH撰写了原稿。MCL, AJF, AA, JES, JAH和ADC审阅和编辑了手稿。艺发局及艺发会督导研究。作者们阅读并批准了最终稿。

相应的作者

对应到凯文M.-C。李

道德声明

伦理批准和同意参与

实验得到了墨尔本大学动物伦理委员会和GSK动物护理、福利和治疗政策的批准。

同意出版

不适用

相互竞争的利益

J.E.史密斯是GSK的员工和股东。

额外的信息

出版商的注意

卡塔尔世界杯常规比赛时间施普林格自然对出版的地图和机构附属的管辖权要求保持中立。

补充信息

附加文件1:图S1。

的依赖关系Csf2肿瘤坏死因子Ccl17而且Il23p19酶促关节炎关节中mRNA的表达。WT,Il23p19-/-gm - csf-/-肿瘤坏死因子-/-而且Ccl17E / E小鼠接受关节内注射生理盐水或酶沙。(A)关节mRNA表达(第7天)Csf2肿瘤坏死因子Ccl17和(B)Il23p19进行了分析。数据以平均值±SEM表示;WT (a - b),Il23p19-/-gm - csf-/-肿瘤坏死因子-/-而且Ccl17E / E雌性老鼠(生理盐水n= 5,酵母聚糖n= 8)。统计分析采用双向方差分析。#p< 0.05, # #p< 0.01, # # #p<0.001,生理盐水vs zymosan。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, WT vs。Il23p19-/-gm - csf-/-肿瘤坏死因子-/-老鼠,分别。

附加文件2:图S2。

最佳的mbsa诱导的滑膜巨噬细胞反应需要IL-23。(A-C)分析naïve和注射mbsa的关节(第1天)的中性粒细胞和巨噬细胞Il23p19-/-老鼠。(A)代表性的FACS图显示用于识别滑膜中性粒细胞的门控策略(CD11b)+Ly6G+)和巨噬细胞(CD11b+F4/80+) (R2);(B-C)总细胞数(CD45+)、中性粒细胞(R1)和巨噬细胞(R2)在(B) naïve和(C) mbsa注射关节(第1天)Il23p19-/-老鼠。(D-E)来自naïve的血液单核细胞和中性粒细胞的分析Il23p19-/-老鼠。(D)具有代表性的FACS图显示用于识别单核细胞的门控策略(CD11b+CD115+(R3)和中性粒细胞(CD11b+Ly6G+) (R4);(E)血液中白细胞、单核细胞(R3)和中性粒细胞(R4)的总数。数据以平均值±SEM表示;WT和(c)Il23p19-/-雌性老鼠(盐/ mBSAn=10), (E) WT和Il23p19-/-雌性老鼠(n= 6)。统计分析采用非配对Student 's t检验。* p < 0.05 WT vs。Il23p19-/-老鼠。

权利和权限

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李,K.MC。,Zhang, Z., Achuthan, A.et al。IL-23在小鼠关节炎和炎症性疼痛发展中的作用。关节炎Res其他22123(2020)。https://doi.org/10.1186/s13075-020-02212-0

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关键字

  • IL-23
  • gm - csf
  • 肿瘤坏死因子
  • CCL17
  • 关节炎
  • 疼痛