acpa阴性RA由亚组组成:在疾病出现时，可通过血清学标记确定患者极有可能实现持续无dmard缓解

背景

疾病修饰性抗风湿药物(DMARD)的无缓解，停用DMARD后滑膜炎持续消失，越来越容易实现，特别是在自身抗体阴性的类风湿性关节炎(RA)。然而，潜在的机制尚不清楚，达到这一结果的患者亚组也没有充分的特征。我们评估了在多生物标志物疾病活度(MBDA)评分中测量的疾病开始时的血清学生物标志物是否在达到持续无dmard缓解的RA患者中有不同的表达。

方法

2999例RA患者在中位随访4.3年期间，评估了持续无dmard缓解的成就。从发病时获得的血清中确定了包括MBDA评分在内的12个生物标志物。患者分为低评分(< 30)、中评分(30 - 44)和高评分(> 44)。基于ACPA阳性和ACPA阴性RA是不同疾病实体的假设，对抗瓜氨酸化蛋白抗体(ACPA)进行分层分析。

结果

20%的患者达到持续无dmard缓解。总体而言，高MBDA评分与实现无dmard缓解相关(高HR vs低HR 3.8, 95% CI 1.2-12.2)。在acpa阴性RA患者中，中、高分与无dmard缓解密切相关(中、低HR 9.4, 95% CI 1.2-72.9;高与低HR 9.7, 95% CI 1.3-71.1)。这种相关性与年龄和其他临床因素无关(高HR vs低HR 8.2, 95% CI 1.1-61.8)。对于acpa阴性RA患者，生物标志物c反应蛋白、血清淀粉样蛋白A和基质金属蛋白酶-3分别与持续无dmard缓解相关。在acpa阳性RA患者中，评分与无dmard缓解无关。

结论

acpa阴性RA患者在停药后获得持续无dmard缓解，诊断时MBDA评分为中高。这是第一个证据表明acpa阴性RA可以在发病时使用蛋白谱在临床相关亚群中细分。

类风湿性关节炎(RA)是一种可能由多种疾病实体组成的综合征。大多数数据集中在RA的差异，其特征是自身抗体的存在和缺乏，特别是抗瓜氨酸化蛋白抗体(ACPA)。一般而言，acpa阳性患者的病程比acpa阴性患者更持久和更具破坏性。在临床诊断为RA并符合各自分类标准的血清阴性患者中产生不同的疾病亚群，迄今为止是不成功的[1］．因此，我们研究是否可以在acpa阴性亚组中确定具有最佳临床结果的患者，目前的临床结果是实现持续的疾病修饰抗风湿药物(DMARD)无缓解。

实现持续无dmard缓解的生物学机制尚不清楚。此外，目前尚不清楚这一结果是否可能适用于所有RA患者，或永久停用dmard的能力是否仅限于一组具有特定生物学特征的RA患者。一些研究表明，较短的症状持续时间(这是一种疾病阶段特征，而不是“患者特征”)与实现持续无dmard缓解的更大概率相关[2，3.，4，5，6］．第二个重要因素是ACPA的缺失[1，2，6］．这表明，能够获得缓解的患者在本质上是不同的。然而，自身抗体的缺失只能部分解释结果的可变性，因为部分acpa阳性患者可以实现持续的无dmard缓解，而大多数acpa阴性患者不能实现[7］．我们假设能够实现持续无dmard缓解的患者与无法实现这一缓解的患者本质上是不同的。如果这一假设是正确的，这些患者可能通过疾病表现时的生物标志物来识别。关于系统可测量的标记物，c -反应蛋白(CRP)已被研究过，一项研究表明，c -反应蛋白水平升高与持续无dmard缓解相关[2，而在另一项研究中没有观察到两者之间的联系[8］．其他炎症蛋白与持续无dmard缓解的关系尚未被研究。

多种血清学生物标记物结合在多生物标记物疾病活性(MBDA)评分中，该评分用于测量类风湿关节炎疾病活性[9，10］．MBDA评分中结合的12个生物标志物的水平可能表明RA疾病活性的相关途径，这些标志物的结合可能比单独的红细胞沉降率(ESR)或CRP等标志物提供更多的信息。几项研究表明，在病程中测量的较高MBDA评分可预测未来几年的影像学进展[11，12，13]，尽管也有研究显示两者之间没有联系[14，15，16］．尚不清楚评分中包含的血清学生物标志物是否与相反的、有利的结果相关，即实现持续的无dmard缓解。

我们的最终目的是确定在疾病表现时可识别的RA患者亚组，对其持续无dmard缓解是一个可实现的结果。我们假设，单个血清学标记或这些标记的组合有助于描述这些亚组。因此，我们调查了首次出现RA时的MBDA评分及其组成的血清学标记物与持续无dmard缓解之间的关系。我们观察到acpa阴性RA患者亚组有很高的机会实现持续无dmard缓解，可以在诊断时通过蛋白质组合的存在确定。

病人

莱顿早期关节炎临床队列是一项初始队列，该队列招募了临床确诊的关节炎患者，其近期发病且症状持续时间< 2年。在基线时，进行问卷调查，收集关节计数和血液样本，此后每年对患者进行评估[1］．基线血清样本检测CRP水平、ESR、IgG ACPA (EliA CCP (anti-CCP2)， Phadia, Nieuwegein，荷兰)和IgM类风湿因子(RF;如前所述，内部ELISA [17])。入组前患者未使用dmard或糖皮质激素。

在本研究中，我们对2010年至2015年纳入的RA患者进行了评估，因为这是最近的纳入期，而且我们已经证明，通过当前的治疗策略，持续无dmard缓解越来越容易实现[8］．由一位经验丰富的风湿病专家对风湿性关节炎的临床诊断严格定义为风湿性关节炎。除临床诊断外，患者须在首年内符合1987年或2010年的分类标准[18，19］．这两种分类标准都被考虑在内，因为acpa阴性患者可能被2010标准错误分类，因为他们需要> 10个受累关节才能达到6分。因此，所有纳入的RA患者都有RA的临床诊断，并且满足RA的分类标准。在随访期间诊断出风湿性关节炎以外的患者不包括在本研究中。在上述期间，有321名患者符合条件。13名患者被排除在外，因为他们在随访期间没有使用dmard, 9名患者被排除在外，因为MBDA生物标志物测量失败。因此，共研究了299例患者。

RA的初始治疗为甲氨蝶呤，在DMARD开始时可联合小剂量强的松桥接治疗。通常情况下，当第一次治疗失败时，开始或添加另一种传统的DMARD。对于≥2个常规DMARD无效的患者，允许使用生物DMARD。在整个观察期间，91%的患者曾使用过甲氨蝶呤，85%曾使用过其他传统的dmard(全身糖皮质激素、柳氮磺胺、羟氯喹、来氟米特或硫唑嘌呤)，20%曾使用过生物制剂。acpa阳性患者更频繁地使用生物制剂;详情见附加文件1S1:表。根据当地和国际指南，DAS < 2.4时采用DAS44治疗，DMARD逐渐减少，DAS≥2.4时加强治疗[20.］．在DMARD逐渐减少后，如果在临床关节检查中DAS44仍然< 2.4且滑膜炎不存在，则停止DMARD。此后，随访患者滑膜炎复发或无dmard缓解持续。研究获得当地医学伦理委员会批准，所有患者签署知情同意书。

持续DMARD-free缓解

直到2017年4月，我们回顾了所有患者的医疗档案，以确定持续无DMARD缓解的发生，这被定义为在整个随访期间停止所有DMARD治疗(包括生物制剂和全身和关节内皮质类固醇)后持续无滑膜炎(通过体检)，且必须在停药后至少1年。持续无dmard缓解的日期定义为停药后1年的日期。没有达到缓解的患者在医疗档案被查阅或他们失去随访时被删除。1例患者实现了持续的无dmard缓解，但在随访期间复发，被认为没有缓解。

MBDA分数

在疾病出现时，在开始任何DMARD治疗(包括糖皮质激素)之前收集血清样本，并保存在−80°C。Crescendo Bioscience(南旧金山，CA, USA)使用三种独立的多重夹心免疫测定法测量12种生物标志物的浓度:CRP、IL-6(白细胞介素-6)、SAA(血清淀粉样蛋白A)、TNFR1(肿瘤坏死因子受体超家族成员1A)、EGF(表皮生长因子)、VEGF-A(血管内皮生长因子-A)、VCAM-1(血管细胞粘附分子-1)、MMP-1(基质金属蛋白酶-1)、MMP-3(基质金属蛋白酶-3)、YKL-40(人软骨糖蛋白-39)、抵抗素和瘦素。对临床数据和结果进行盲法测量。通过使用之前指定的算法计算MBDA评分，对这些生物标志物进行了单独研究和组合研究，评分范围从1到100 [9，10，21］．该MBDA算法以DAS28-CRP作为参考来测量疾病活动性。在分析中，根据之前建立的阈值将患者分为低(< 30)、中等(30 - 44)和高(> 44)MBDA评分类别[10］．虽然我们使用MBDA评分的目的与测量疾病活动性不同，但我们使用相同的分界点进行分类。

统计分析

采用Kaplan-Meier分析，以MBDA分类和12个个体生物标志物作为分组因素，评估实现持续无dmard缓解的率。在后一种分析中，根据生物标志物水平将患者分为tertile，创建三个大小相等的组。采用单变量Cox比例风险回归分析评估基线特征与持续无dmard缓解之间的关系。的基线变量p值< 0.10纳入多变量分析，以评估血清学标记物与实现持续无dmard缓解之间的独立关系。由于实现持续无dmard缓解主要局限于ACPA阴性RA，而且由于我们的目标是在ACPA阴性和ACPA阳性RA中寻找亚组，因此对ACPA的存在进行了分层分析。使用SPSS 23.0版本(IBM)。p< 0.05为显著值。

病人的特点

299例RA患者的基线特征见表1．首次出现时的中位症状持续时间为15周(四分位范围(IQR) 8-32)，与其他早期关节炎队列相似，53%的患者ACPA阳性[22，23］．

持续无dmard缓解的发展和MBDA评分的分布

中位随访时间为4.3年(IQR 4.0-4.7)。在中位随访2.9年(IQR 2.2-4.0)后，20% (59/299)RA患者实现了持续无dmard缓解。acpa阳性患者中7%(11/158)和acpa阴性患者中34%(48/141)达到持续无dmard缓解。

通过MBDA评分反映的血清学标记的组合与acpa阴性RA中持续无dmard缓解相关

首先，评估所有RA患者在随访期间实现持续无dmard缓解与发病时MBDA评分之间的关联(图。1a).以低MBDA评分患者为参照，中度MBDA评分患者发生持续无dmard缓解的概率增加(风险比(HR) 3.42, 95%可信区间(CI) 0.97-12.02)。在MBDA评分高的患者中观察到类似的增加概率(HR 3.79, 95% CI 1.18-12.22)。接下来，根据ACPA的存在对患者进行分层。1b, c)。对于acpa阳性RA患者，基线MBDA类别与实现持续无dmard缓解无关(中vs低HR 0.75, 95% CI 0.10-8.19;高vs低HR 0.89, 95% CI 0.19-4.31)。相比之下，在acpa阴性RA患者中，中、高MBDA评分与实现持续无dmard缓解密切相关(中、低HR 9.40, 95% CI 1.21-72.85;高vs低HR 9.73 95% CI 1.33-71.10)。在低MBDA评分的acpa阴性组中几乎没有持续的无dmard缓解(该组中只有1例患者在6年随访后实现缓解)，而在中、高MBDA评分的acpa阴性组中，有38%的患者实现了持续的无dmard缓解。将acpa阴性且MBDA评分中、高的RA患者与MBDA评分低的RA患者进行比较，达到缓解的HR为9.65 (95% CI 1.33-70.04)。因此，只有acpa阴性RA患者，诊断时的血清学标志物组合(由MBDA评分反映)与实现持续无dmard缓解相关。

与持续无dmard缓解相关的血清学标记的组合，独立于临床因素

接下来，我们研究了基线MBDA评分和acpa阴性患者持续无dmard缓解之间的关联是否独立于临床特征。在临床基线特征、发病年龄、66-肿胀关节计数和是否存在与持续无dmard缓解相关的RF中，apacpa阴性RA值< 0.10;这些特征包括在多变量分析(表2)．在该分析中，MBDA类别与持续无dmard缓解相关，独立于这三个因素，中、低HR分别为6.96 (95% CI 0.88-55.31)和8.19 (95% CI 1.09-61.78)(表2)．

在acpa阴性RA患者中，较高的CRP、SAA和MMP-3水平与实现持续无dmard缓解相关

接下来，研究acpa阴性RA患者观察到的关联是否由MBDA评分的标记子集驱动。因此，我们确定了在acpa阴性RA患者中，MBDA评分中包含的12个个体生物标志物的水平与持续无dmard缓解的实现之间的关联1:图S1)。在单个生物标志物中，发病时较高的CRP、SAA和MMP-3水平与随访期间实现持续的无dmard缓解相关。与CRP水平< 7 μg/mL(最低分位数)的患者相比，CRP水平7 - 39 μg/mL(第二分位数)的患者实现持续无dmard缓解的可能性显著增加(HR 3.43, 95% CI 1.62-7.27)，对于CRP水平≥39 μg/mL(最高分位数)的患者，观察到类似的趋势(HR 2.12, 95% CI 0.96-4.70)。此外，与MMP-3水平≤28 ng/mL(最低十位数)的患者相比，MMP-3水平≥60 ng/mL(最高十位数)的患者发展为持续无dmard缓解的可能性显著增加(HR 2.18, 95% CI 1.06-4.48)。SAA水平也与实现无dmard持续缓解相关。与SAA水平≤3 μg/mL(最低分位数)的患者相比，SAA水平≥26 μg/mL(最高分位数)或3 - 26 μg/mL(第二分位数)的患者发生持续无dmard缓解的可能性显著增加(HR 2.87, 95% CI 1.28-6.43, HR 3.03, 95% CI 1.39-6.63)。其他生物标志物与持续无dmard缓解的实现没有单独关联。

acpa阴性且MBDA评分升高的RA患者发病时的临床特征

最后，由于acpa阴性RA患者获得持续无dmard缓解的可能性高，可通过诊断时反映疾病活动性高的蛋白谱来识别，我们评估了这些患者与MBDA评分低的患者相比，是否在临床特征上也有差异。acpa阴性且MBDA评分高的患者更常出现亚急性症状(相对于渐进性或间歇性发作)3.)．与低MBDA评分的acpa阴性患者相比，中等或高MBDA评分的acpa阴性患者年龄约为10岁，首次出现急性相反应物含量较高3.)．这些与诊断时临床特征的关联表明，基于血清学生物标志物分化的acpa阴性RA亚组不仅在长期转归方面存在差异，而且在疾病表现上也存在差异。

这是第一项研究表明acpa阴性RA患者在随访期间很有可能实现持续的无dmard缓解，在基线时可通过血清学标记的组合识别。这种与持续无dmard缓解的联系与临床基线特征无关。此外，acpa阴性亚组有很高的可能性实现持续无dmard缓解，随着他们年龄的增长(平均≥60岁)和更多的出现(亚)急性症状，他们的临床特征显示出一些差异。总之，这表明血清学生物标志物的组合有助于识别acpa阴性RA患者的亚组，这些亚组在基线特征和DMARD停药后维持临床缓解的能力方面存在差异。

基于遗传和环境风险因素以及结果的差异，人们普遍认为acpa阳性RA和acpa阴性RA是不同的RA子集。过去，我们试图在acpa阴性RA患者组中仅根据发病时的临床特征来区分亚组;这没有导致临床可区分的亚组[24］．目前的数据表明，通过血清学标记进行细分是可能的，从这个细分开始，确定的亚组在临床特征上有一些轻微的差异，如acpa阴性、发病时血清学评分中等或较高的RA患者年龄更大，症状更常出现(亚)急性发作，似乎有更大的炎症负担(反映为炎症蛋白水平更高，关节更肿胀的趋势)。这些患者中有38%能够在相对较短的治疗期后永久停用dmard，因为dmard无缓解是在中位疾病持续时间2.9年之后实现的，这意味着dmard停用的中位时间为1.9年。因此，acpa阴性患者的亚组在发病时年龄较大，且往往出现更严重的炎症症状，但相对而言需要短期的DMARD治疗。需要进一步的研究来证实这些发现。

acpa阴性的RA患者不太可能被错误地归类为RA，因为在随访的第一年被诊断为RA以外的疾病(如炎症性骨关节炎和反应性关节炎)的患者不包括在本研究中。同时，实现自发缓解的患者，即不使用dmard，被排除在外。本研究的患者临床诊断为风湿性关节炎并符合分类标准。在目前的分类中，这些患者被称为RA患者。然而，我们的数据支持在acpa阴性RA中可以识别子组的概念。

一项对中位病程为5年、持续缓解的已确诊RA患者的研究表明，在DMARD治疗期间和减少治疗前MBDA评分较高的患者，在减少或在某些情况下停止所有DMARD治疗后，复发风险增加[25］．这可能反映了亚临床疾病的活动，尽管治疗，并与我们的数据在概念上非常不同。在本研究中，MBDA评分用于监测疾病活动性，这是评分的目的。在我们的数据中，我们有一个不同的目标，即在症状持续时间很短的RA患者和在开始使用任何dmard之前进行测量。

在几项研究中，高MBDA评分与影像学进展相关(尽管大多数对ACPA进行了调整但未进行分层)[11，12，13，26］．在我们的研究中，在疾病出现时进行，高MBDA评分与acpa阴性RA的有利预后密切相关。这与以前的发现相反，但这些研究的测量是在疾病持续数年的患者中进行的，研究结果也不同。

我们的研究重点是实现持续的无dmard缓解。在acpa阴性RA患者组中，MBDA评分低的患者很少获得这种良好的结果。在数字上，这一组相对较小(acpa阴性RA患者的12%)。此外，该组类似于acpa阳性RA患者组，也很少达到无dmard缓解。这一acpa阴性亚组可能对(新)自身抗体反应的研究很有意义，因为据推测存在“血清学空白”，这意味着部分acpa阴性患者存在未测定的自身抗体[27］．此外，我们的数据显示，持续无dmard缓解是约一半acpa阴性且MBDA评分中、高的患者的可行结果。

一个限制是，尽管我们门诊的风湿病医生被鼓励在DAS缓解的情况下尝试减少和停止DMARD，但如果患者和风湿病医生觉得这是不合适的，我们没有强迫他们停止DMARD，我们没有记录在DAS缓解和关节肿胀的情况下，有多少次DMARD减少没有进行。因此，能够实现持续无dmard缓解的患者比例可能被低估。可以特别想象的是，在ACPA检测呈阳性的情况下，医生或患者都不愿意降低或停止用药。

另一个限制是，一些患者的随访时间可能不足以发现滑膜炎消失多年后发生的耀斑，因为这可能发生在从门诊出院后。在这项研究中，患者需要处于持续的无dmard缓解状态至少1年，并指导患者在症状复发时返回门诊，这一指导得益于早期关节炎识别诊所的存在，以及我们是该地区唯一的转诊中心[28］．最后一个限制是，血清阴性且MBDA评分低的患者数量相对较少，因此acpa阴性亚组内(多变量)分析的力量有限，导致估计风险比的置信区间较宽。此外，没有执行重采样方法来显示数据的稳健性。因此，我们需要在另一个早期RA队列中验证我们的结果。

本研究中的缓解被定义为停药后滑膜炎的持续消失，因此以医生为中心。由于滑膜炎需要在一段时间内持续消失，这个结果与经常使用的单一时间点的缓解定义不同。重要的是，我们的研究表明，实现持续无dmard缓解的患者功能状态和患者报告的预后正常化，强调这是可能的最佳长期结果[1］．

MBDA检测包括血清中12种蛋白质的水平，这些蛋白质也分别进行评估。在不同的标记物中，CRP、SAA和MMP-3与实现持续的无dmard缓解相关。SAA是一种与急性期反应相关的蛋白质，是RA疾病活性的敏感指标[29，30.］．MMP-3是一种蛋白酶，被认为有助于类风湿关节炎的软骨降解。其水平与影像学进展、疾病活动和炎症有关[31，32，33，34，35，36］．由于MBDA评分并不是用来评估哪些患者可能实现无dmard缓解，因此可以推测，除了本文研究的12种蛋白外，其他蛋白在acpa阴性RA亚组中也有不同的表达。需要进一步的研究来更好地从血清学上描述这个亚组。此外，还需要进行生物学研究，以确定与这类RA患者的发展相关的途径。

总之，acpa阴性RA患者在随访期间获得持续无dmard缓解，其特征是疾病出现时蛋白表达的差异。这是第一个证据，acpa阴性RA可以在疾病发作时在临床相关亚组中进行细分，这些亚组在治疗停药后实现和维持临床缓解的可能性上存在差异。

ACPA:

Anti-citrullinated蛋白抗体

置信区间:

置信区间

c反应蛋白:

c反应蛋白

DAS:

疾病活动得分

DMARD:

疾病修饰治疗风湿病的药物

表皮生长因子:

表皮生长因子

ESR:

红细胞沉降率

人力资源:

风险比

il - 6:

白细胞介素- 6

差:

四分位范围

MBDA:

Multi-biomarker疾病活动

金属蛋白酶- 1:

矩阵metalloproteinase-1

MMP-3:

矩阵metalloproteinase-3

类风湿性关节炎:

类风湿性关节炎

射频:

类风湿因子

南非航空公司:

血清淀粉样蛋白一

TNFR1:

肿瘤坏死因子受体超家族成员1A

VCAM-1:

血管细胞粘附分子-1

VEGF-A:

血管内皮生长因子a

YKL-40:

人类软骨glycoprotein-39

不适用。

资金

该项目已获得欧洲研究理事会(ERC)在欧盟地平线2020研究和创新计划下的资助(启动拨款，协议号为。714312)和荷兰关节炎协会。

数据和材料的可用性

资料可向通讯作者索取。

作者和联系

1. 莱顿大学医学中心风湿病科，邮政信箱9600，邮编2300 RC，荷兰莱顿

   Debbie M. Boeters, Leonie E. Burgers, Tom W. J. Huizinga & Annette H. M. van der Helm - van Mil

2. Crescendo Bioscience，南旧金山，CA，美国

   埃里克·h·萨索

3. 荷兰鹿特丹伊拉斯谟大学医学中心风湿病学系

   安妮特H. M.范·德·赫尔姆-范·密尔

贡献

DMB和AHMvdHvM对概念和研究设计有贡献。DMB和LEB有助于数据的获取。DMB分析了这些数据。DMB、LEB、EHS、TWJH和AHMvdHvM对数据解释有贡献。DMB和AHMvdHvM编写了初版手稿，LEB、EHS和TWJH对其进行了严格的修订。DMB、LEB、EHS、TWJH、AHMvdHvM审阅审稿。

相应的作者

对应到黛比·m·Boeters．

作者的信息

不适用。

伦理批准和同意参与

该研究得到了莱顿大学医学中心医学伦理委员会(CME)的批准。所有患者均签署知情同意书。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

ES是Crescendo Bioscience Inc.的员工，并持有该公司的股票期权。其他作者宣称他们没有竞争利益。

出版商的注意

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