抑制抗增殖因子Tob1在骨关节炎软骨

骨关节炎是现代社会最常见的退行性疾病。然而，人们对该病的许多基本细胞特征和分子过程了解甚少。在本研究中，我们使用基于寡核苷酸的微阵列分析已知或假设与细胞表型相关的基因，以筛选正常和骨关节炎软骨细胞之间基因表达的相关差异。定制的寡核苷酸DNA阵列用于筛选正常(n= 9)和骨关节炎(n=软骨样本。采用实时聚合酶链反应(PCR)和基因特异性引物进行定量。采用原代人成人关节软骨细胞和软骨肉瘤细胞系HCS-2/8，研究白细胞介素-1β和骨形态发生蛋白刺激后基因表达水平的变化，以及对细胞分化的依赖性。原位用基因特异性探针杂交检测胎儿生长板软骨mRNA表达水平。总的来说，在正常和骨关节炎软骨之间检测到超过200个显著调节的基因(P< 0.01)。其中一个被显著抑制的基因，Tob1它编码一种蛋白质，该蛋白质属于一个家族，与抑制细胞增殖和功能活动有关。的压迫Tob1与软骨细胞活性和增殖标志物相关在活的有机体内．Tob1在分离的软骨细胞和软骨肉瘤细胞系HCS-2/8中也检测到表达水平下降。在这些细胞中，它与增殖活性呈负相关，与细胞分化呈正相关。总的来说，表达的下调Tob1在骨关节炎中，软骨细胞可能是发生在骨关节炎软骨退变过程中的一个重要方面。激活，增殖活性的重新开始和稳定表型的丧失是骨关节炎软骨细胞的三个主要变化，与的抑制高度显著相关Tob1表达式。

骨关节炎是西方世界人类最常见的致残疾病。虽然骨关节炎主要是一种疾病和覆盖在关节表面的关节软骨的功能丧失，但很明显，在疾病过程中，细胞是活跃的玩家[1］．无论在骨关节炎疾病过程中，细胞反应模式在第一眼看到时表现出怎样的多形性，它们基本上可以总结为三类(在[2])。首先，软骨细胞可以退化或增殖。其次，软骨细胞可以通过增加或减少合成代谢或分解代谢基因的表达来激活或激活其合成合成代谢或分解代谢基质降解活性。最后，软骨细胞可以经历表型调节，这意味着病变组织中细胞基因表达谱的整体严重改变。事实上，几种不同的软骨细胞表型是已知的在体外，在活的有机体内在胎儿发育过程中，也可能在疾病过程中，但需要新的标记物来更准确地表征细胞行为[3.］．这将允许进一步分析潜在的病理，以开发治疗方法，可以延迟，停止，甚至逆转软骨退变。

许多实验室已经对正常和骨关节炎软骨标本进行了单基因和多基因分析;然而，目前还没有疾病相关变化的全球概览。这强调了需要通过现代筛选技术建立更广泛的骨关节炎软骨细胞基因表达谱，以便更准确地描述直接参与软骨破坏的细胞事件和调控途径。在目前的研究中，我们设计了一个定制的寡核苷酸基微阵列来筛选正常和骨关节炎软骨标本中差异表达的基因。我们发现Tob1，一个参与细胞周期调节和细胞静止的基因[4，5]，在骨关节炎软骨细胞中被显著抑制。定量聚合酶链反应(qPCR)证实了这一点，并进一步在成人关节软骨细胞中进行了分析在体外而且在活的有机体内．

mRNA表达分析的供体

为了研究组织内mRNA的表达水平，使用正常膝关节的人股骨髁软骨。正常的关节软骨(n_qPCR= 10人，年龄45-88岁，平均年龄64.1岁;n_数组= 9人，年龄37-83岁，平均59岁)，来自于死亡后48小时内的尸检供体。晚期骨关节炎关节疾病的骨关节炎软骨样本来自接受全膝关节置换术的患者(n_qPCR= 15人，年龄63-85岁，平均74.5岁;n_数组= 10人，年龄57 - 84岁，平均76岁)。软骨取出后立即在液氮中冷冻，并在-80°C保存，直到需要进行RNA分离。

根据打开关节的宏观评分系统认为软骨正常:主要包括正常的滑膜、正常的滑膜液，没有明显的整体软化或表面颤动(除了胫骨平台，根据年龄，基本在所有标本中都存在)。组织学标本Mankin分级小于3级。骨关节炎病例符合美国风湿病学会公布的标准[6］．类风湿起源病例被排除在研究之外。

人原代关节软骨细胞的分离;白细胞介素(IL)-1β和骨形态发生蛋白(BMP)-7刺激

6例正常人膝关节软骨在死亡48小时内解剖获得。软骨块被切碎，软骨细胞被酶法分离，如前所述[7］．软骨细胞在高密度单层培养或海藻酸珠培养。培养在无血清Dulbecco's改良Eagle's培养基/F12培养基(Gibco BRL, Eggstein, Germany)中保持48小时，添加1%青霉素/链球菌霉素溶液(Gibco BRL)和50 μg/ml抗坏血酸(Sigma, Taufkirchen, Germany)和10%胎牛血清(Biochrom, Berlin, Germany)。

48小时后，用1 ng/ml IL-1β (R&D System, Minneapolis, MN, USA)在DMEM/F12培养基中刺激原代(非传代)软骨细胞，100 ng/ml重组人BMP-7 (Stryker Biotech, Hopkinton, MA, USA)或在培养基中单独培养24小时，之后培养基无变化。同样的实验在有和没有10%胎牛血清的情况下并行进行。在培养/刺激期结束时，细胞在无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤，用350 μl裂解液RLT缓冲液/10溶解⁶细胞和储存在-80°C。

HCS-2/8细胞培养

人HCS-2/8软骨肉瘤细胞系(约50-55传代)[8，9]在添加20%胎牛血清(Gibco BRL)和50 μg/ml抗坏血酸(Sigma)的DMEM (PAA, Linz, Austria)中培养，在5% CO的潮湿气氛中培养₂在37°C下，如所述[9］．细胞在10时播种⁵细胞/厘米²在2 × 10的培养条件下，培养3天，获得次融合的阶段培养物⁵/厘米²培养7 d，获得合流期培养基，6 × 10⁵/厘米²在过度融合的舞台培养中生长了10天。

从关节软骨中分离RNA和分离的关节软骨细胞

如前所述，从软骨组织和分离软骨细胞中分离总RNA [10，11］．通过琼脂糖凝胶电泳和生物分析仪RNA 6000纳米分析(Agilent, Waldbronn，德国)检查总RNA样本的质量。

SensiChip软骨微阵列的构建

SensiChip技术是一种使用平面波导技术进行微阵列检测的双色微阵列平台[12]，这增加了信噪比，从而提高了杂交实验的灵敏度。这些序列是重复的，其中70个寡核苷酸代表大约340个人类软骨相关基因的3'非翻译区(UTR)，而一个单基因由一个70个寡核苷酸代表。

使用SensiChip双色dna微阵列平台进行表达分析

从骨关节炎软骨(10个样本)和聚集的正常软骨中扩增总RNA (250 ng)，并用MessageAmp aRNA试剂盒(Ambion)分别用Cy3-UTP和Cy5-UTP标记(Amersham Pharmacia)。用RNeasy试剂盒(Qiagen)清除补充RNA (cRNA)后，从骨关节炎软骨中提取5 μg cy3标记的cRNA与从聚集的正常软骨中提取5 μg cy5标记的cRNA混合。将cRNA与40 mM Tris-acetate, pH值8.1,100 mM醋酸钾，30 mM醋酸镁在95°C孵育15分钟，并用Microcon YM-10浓缩器(Millipore)淡化。混合cy -染料标记的cRNA样本(600 ng)在SensiChip微阵列(Qiagen)上杂交16小时，与代表所选基因3' UTR的70聚寡核苷酸进行重复标记。利用GenBank登录号和专有算法设计基因特异性寡核苷酸序列。按照制造商的标准协议执行洗涤步骤后，使用SensiChip Reader对阵列进行扫描。使用SensiChip View 2.1软件(Qiagen)对得到的阵列图像进行分析，以量化基因特异性信号强度。

为了对RNA标记和杂交效率进行质量控制，还包括了代表人类管家基因的寡核苷酸、阴性和外部细菌穗控。这些序列用荧光Cy3和Cy5染料预标记，并以不同浓度混合到含有标记的人软骨cRNA样本的杂交溶液中。

表达数据分析

所有微阵列扫描都进行了视觉检查，并根据阴性、清洁和外部添加的预先标记的Cy3/ cy5的峰值控制组的表现来检查质量。每次扫描的原始信号强度被导入到基因表达分析软件Resolver 4.0 (Rosetta Biosoftware, Seattle, WA, USA)中。该软件采用误差建模方法对微阵列数据进行分析[13］．基于相同RNA材料的重复杂交表达数据，Rosetta Biosoftware设计了专门用于SensiChip微阵列平台的误差模型，以确定信号强度的变化。在罗塞塔生物软件网站的技术部分可以找到关于所使用统计方法的完整描述http://www.rosettabio.com/tech/default.htm．

所有扫描都进行了预处理和归一化处理，并用SensiChip误差模型进行计算P每个基因表达谱的值和错误条。的P值表示观察到的基因调控是由于测量误差造成的概率。基因调控被认为有统计学意义，如果计算P值低于0.05的阈值。对于表达数据的归一化，分别使用Cy3和Cy5通道的平均亮度，这是在所有光点信号强度分布的30% - 85%范围内的点计算得出的。通过使用误差加权算法(在Rosetta Biosoftware网站上的统计方法文档中也有描述)对多个实验(重复)的扫描进行平均表达数据的组合。

TaqMan技术实时定量PCR

采用Real-time PCR检测人Tob1，胶原蛋白II型，ki - 67，基质金属蛋白酶(MMP) -13而且glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶人关节软骨RNA样本中mRNA的表达水平。引物(MWG Biotech, Ebersberg, Germany)和TaqMan探针(Eurogentec, Liège, Belgium)使用Primer Express™软件(Perkin Elmer)设计。为了能够获得所有基因的可量化结果，使用特定序列控制探针的特定标准曲线与分析并行进行。因此，对于每个基因，一个基因特异性的cDNA片段被基因特异性引物扩增(表1)并克隆到pGEM T Easy (Promega，曼海姆，德国)或pCRII TOPO (Invitrogen，卡尔斯鲁厄，德国)。对克隆的扩增产物进行测序，以确认克隆正确。克隆的标准探针用质粒扩增试剂盒(Qiagen)扩增，线性化，并在仔细估计浓度(凝胶电泳、光度法和脱氧核糖核酸荧光测定法(Picogreen;分子探针，尤金，OR，美国))。标准曲线使用浓度为10,100,1000,10,000,100,000，和1,000,000的分子每次测定(均为三份)。

为了分析不同的基因，每个引物对分别组成一个单独的主混合物，包含最终浓度为200 μM的NTPs、600 nM的Roxbuffer和100 nM的TaqMan探针。对于最终反应混合物中所含的所有基因，除cDNA和1u聚合酶(Eurogentec)外，还有正向和反向引物、相应探针和MgCl₂浓度如表所示1．所有实验均为3个重复。

免疫荧光

免疫荧光研究多聚甲醛固定石蜡包埋的正常(n= 5)和骨关节炎(n=关节软骨。切片首先与一级抗体孵育一夜，然后与生物素标记的山羊抗小鼠抗体(Dianova, Hamburg, Germany)，然后与过氧化物酶标记的链霉亲和素(Dianova)孵育一夜。随后，采用酪氨酸胺扩增系统(PerkinElmer, Boston, MA, USA)进行信号扩增。最后用cy5标记的链霉亲和素(Dianova)检测信号。再次用4,6-二胺基-2-苯基吲哚进行核染色。切片用(荧光)显微镜(Olympus AX70)进行评估，并进行数码拍照。

为了获得最佳的染色结果，测试了各种酶预处理，包括透明质酸酶(Boehringer, Mannheim, Germany;2 mg/ml PBS pH值5在37°C下60分钟)，pronase (Sigma, Deisenhofen，德国;2 mg/ml PBS pH 7.3在37°C下60分钟)，细菌蛋白酶XXIV (Sigma;0.02毫克/毫升;PBS pH 7.3，在37°C下60分钟)。最后，小鼠抗Tob1单克隆抗体(Assay Designs, Ann Arbor, MI, USA)在1:20的稀释条件下使用，未对切片进行预处理。

基因的扩增和克隆Tob1互补脱氧核糖核酸

按照Trizol提取方法从分化的ADTC5细胞(Ricken文库)中分离RNA^®使用SuperScript II™逆转录酶(Invitrogen)按照制造商的推荐反转录成cDNA。

PCR扩增607碱基对Tob1cDNA片段(GenBank中序列的核苷酸402-1008号登录号。NM_009427)用基因特异性引物(正向，5'-GGAGCCCCCAGGTGTTCATGC-3';5'-CTCGTTGAGGCCTCCGTAGG-3')，并将扩增产物克隆为pCR^®-BluntII-TOPO^®向量(表达载体)。

原位杂交

原位用地高辛标记的反义核探针对新生小鼠的阑尾骨骼切片进行杂交Tob1互补脱氧核糖核酸片段。新生小鼠后腿固定于4%多聚甲醛溶液PBS中过夜。通过乙醇浓度增加的溶液逐步转移后，在二甲苯中培养，最后在石蜡中包埋。

为原位将石蜡包埋样品切成7 μm厚的切片，置于载玻片上。用地高辛-11- utp标记的反义核探针进行杂交，反义核探针用T7 RNA聚合酶转录Tob1cDNA片段克隆成pCR^®-BluntII-TOPO^®(Invitrogen)，线性化后的质粒与Bam嗨。

原位按照Dietz和同事的描述进行杂交[14］．在检测到杂交产物后，切片被安装在Kaiser的甘油明胶(默克)的覆盖套下，并在蔡司Axioplan 2显微镜下拍照。

SensiChip软骨微阵列的构建

构建了覆盖340个人类软骨相关基因的微阵列，其中一个单基因由一个70聚寡核苷酸表示(图5)。1)．大多数基因是从文献中选取的，在骨关节炎的合成代谢或分解代谢途径中具有重要作用(例如软骨基质蛋白，如胶原蛋白，相关降解酶，如mmp和aggrerecanase，以及重要的分解代谢[IL-1，肿瘤坏死因子-α]和合成代谢[BMP，转化生长因子-β]信号通路中的基因)。

基因表达分析:差异表达基因

来自10个晚期骨关节炎软骨样本的总rna分别与来自9个正常软骨供体的混合总rna池在定制的SensiChip微阵列上杂交。合并所有10个晚期骨关节炎软骨样本用于杂交的表达谱，结果发现约200个显著调控基因在正常和骨关节炎软骨之间表达差异P< 0.01(图。2和表2；整个数据集都在里面额外的文件1)．

Tob1骨关节炎软骨细胞是否受到抑制

其中一个差异表达基因是ERBB2,1的人类换能器(Tob1；加入基因库。NM_005749)。Tob1在所有10个人类骨关节炎软骨样本中，平均转录下调至六分之一(图。1)．相应的P所有人类OA样本的值都小于0.05。

确认Tob1通过定量PCR和免疫染色在正常和骨关节炎关节软骨中的表达和调控

常规PCR证实表达Tob1，均为正常(n= 3)和骨关节炎(n= 3)软骨细胞，在骨关节炎样本中检测到较弱的信号(图。3)．验证和量化差异调节Tob1， qPCR在一组正常(n= 10)和骨关节炎(n= 15)样本。这些实验证实了它在正常关节软骨中的表达和高度显著的减少Tob1骨关节炎样本中的转录水平(7.8倍;P< 0.001;无花果。3 b)．

用抗Tob1单克隆抗体免疫定位显示存在Tob1正常蛋白质含量(n= 5)和骨关节炎(n= 8)关节软骨细胞(图。3 c, d)．与正常标本相比，骨关节炎标本的染色较弱，但由于使用了免疫染色技术，这是无法量化的。

的相关性Tob1软骨细胞合成代谢、分解代谢和增殖标志物的表达

接下来我们研究了Tob1基因表达水平与细胞增殖标记基因表达相关(ki - 67)和合成代谢(胶原蛋白II型)和分解代谢(MMP-13)激活关节软骨细胞。该分析显示，与正常软骨细胞相比，骨关节炎的这些基因之间存在高度显著的相关性。4)．

的表达Tob1在关节软骨细胞在体外

Tob1是否在分离的成人关节软骨细胞中表达在体外．mRNA的表达水平Tob1体外与骨关节炎的软骨细胞相似吗原位因此明显低于正常软骨细胞原位(oligo-array,无花果。1 d；qPCR,无花果。3 b)．值得注意的是Tob1在无血清培养的细胞中比有血清培养的细胞表达更强。没有明显的监管Tob1是由两种主要的合成代谢(BMP-7)和分解代谢(IL-1β)介质在培养软骨细胞中的成人关节软骨中发现的在体外(数据没有显示)。

的表达Tob1在胎儿生长板和软骨细胞分化过程中在体外

原位对小鼠胚胎生长板软骨进行杂交，以评估不同软骨带的差异表达。这表明表达Tob1集中在增生区(分化和增殖停止区)。静息区和增殖区(即增殖和基质合成区)的细胞没有染色或染色非常弱(图。3 e)．此外，成骨细胞呈阳性(未显示)。

HCS-2/8细胞的表达谱，已知其在高密度培养中比在次融合或融合状态下培养时表现出更分化的表型[15显示出了相反的关系Tob1表达和增殖标记ki - 67(无花果。5)．

我们对正常和骨关节炎软骨细胞进行的差异基因表达分析，揭示了一长串差异表达基因，对进一步了解、诊断和/或调节骨关节炎具有潜在的兴趣。在这三个方面的任何一个方面，鉴定出的基因都可能是有趣的，但需要仔细的验证来确认所获得的结果的相关性。在这方面，必须实现三个级别的验证:(1)筛选结果的技术验证，(2)基因的功能验证原位或在体外，最后(3)建立基因与组织(生理和/或)病理生理的相关性。

在我们以寡核苷酸为基础的阵列筛选中，我们检测到许多已知的差异表达基因。因此，许多标记基因的表现与之前的研究预期一致:MMP-3) [7和软骨转录因子SOX9［16]显著下调，而细胞外基质的许多成分则显著上调(胶原蛋白类型二世［17]，3［18]，6［19]，电脑及相关知识［20.),而纤连蛋白［21])。此外，骨关节炎软骨的主要胶原酶MMP-13 [22，23，被诱导[7])。综上所述，这些发现证实了这种基因阵列技术是一种鉴别差异表达基因的可靠工具。此外，在骨关节炎软骨中检测到许多以前未知的差异调控基因。

在我们发现的新的差异表达基因中Tob1与正常关节软骨细胞相比，骨关节炎患者的软骨细胞明显下调。对于技术验证(验证级别I)，这是通过常规和定量PCR在非常显著性水平上确认的。免疫染色为正常和骨关节炎软骨细胞中存在Tob1提供了额外的证据。

Tob1，最初被认定为Erb的绑定伙伴(' Erb的转换器' [24])，是一个更大的蛋白质家族的成员，拥有共同的蛋白质结构域，已知对包括成骨细胞在内的各种细胞类型发挥抗增殖和表型稳定作用([24，25];综述了在4]和[5])。

从而，获得对功能活动的洞见Tob1在关节软骨中(验证级别II)，我们将Tob1的表达与ki - 67抗原，一种只在增殖期的细胞中表达的成熟基因[26］．我们发现了非常显著的负相关Tob1软骨细胞的表达和增殖活性。值得注意的是，从关节基质分离出来后Tob1正常关节软骨细胞也受到抑制在体外．这可能很好地反映了一个事实，即成人关节软骨细胞的增殖活性增强，合成代谢也增强。27和分解代谢活性[7从组织中取出后。细胞与血清一起培养在体外显示更低Tob1表达水平比无血清培养进一步支持这一观点，因为血清是已知的增加软骨细胞增殖在体外［28］．此外，软骨细胞细胞系HCS-2/8的增殖活性和细胞分化与Tob1表达呈反比关系。有趣的是,胎儿软骨细胞原位选择性地在肥厚区表达Tob1，这与其他没有看到增殖活性的区域形成对比[25］．这表明Tob1软骨细胞中的表达与增殖呈负相关，其方式与T细胞中的表达类似[29］．另一个基本效应Tob1在软骨细胞中也观察到:抑制Tob1在激活静止的T细胞之前[29，30.];同样，(合成代谢和分解代谢)软骨细胞活性与Tob1表达之间存在明显的负相关。

在许多方面的下调Tob1很好地符合骨关节炎期间发生的情况(验证级别III)，这表明Tob1是骨关节炎软骨细胞表型调节的潜在关键分子。因此，在骨关节炎的软骨中增殖增加[31- - - - - -35]，而在正常的成人关节软骨中几乎不存在任何增殖活动[31，32］．这些细胞似乎是g0阻滞的，静止的，表型稳定的，换句话说，正是这种细胞类型被期望表达高水平的Tob1［4，29］．值得注意的是，表型不稳定性[36和合成代谢激活[17是骨关节炎软骨细胞的关键特征，与下调Tob1．

Tob1似乎在许多情况下，特别是在骨骼细胞中，与BMP途径相互作用[37］．由于缺乏对bmp刺激的骨生长的抑制，top1敲除小鼠会发生骨质硬化[37］．此外，过表达Tob1减少BMP2信号[38］．虽然在Tob1-敲除小鼠无明显的“增生性”软骨表型，BMP-2和BMP-7据报道在软骨稳态中具有重要功能[39，40］．因此，Tob1的存在可以解释为什么尽管关节软骨中存在bmp [39]，正常软骨细胞只有非常低的合成代谢活性。基于同样的论点，骨关节炎的软骨细胞bmp可能有更大的合成代谢潜力，最近的研究表明这一特征在体外［27］．

总之，我们的研究首次提供了令人信服的证据，证明了top1作为一种新的细胞内介质在成人关节软骨细胞中的表达和存在，以及它在骨关节炎疾病过程中的下调。在功能上，Tob1与这种情况下发现的细胞生物学变化很吻合，如增殖、激活和分化表型的丧失。我们的数据，以及文献中其他细胞系统的知识，都表明Tob1是骨关节炎细胞改变的关键分子。

以寡核苷酸为基础的微阵列分析用于筛选正常和骨关节炎软骨细胞之间的基因表达水平的差异。其他基因,Tob1被发现在骨关节炎软骨细胞中显著下调。相关的细胞特征基因表达研究，如细胞增殖，细胞激活和分化表型的丧失，表明下调Tob1表达可能是骨关节炎软骨退变细胞过程的一个重要方面。

骨形态发生蛋白:

骨形成蛋白

互补脱氧核糖核酸:

互补脱氧核糖核酸

cRNA:

互补的RNA

IL:

白介素

MMP的:

基质金属蛋白酶

PBS:

磷酸盐

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

qPCR:

定量聚合酶链反应

UTR:

未翻译。

我们感谢Klaus Lindauer博士(赛诺菲-安万特制药，法兰克福，FRG)的生物信息支持，以及Chris Barnes博士(赛诺菲-安万特制药，法兰克福)对手稿的批判性阅读。我们非常感谢Anke Nehlen女士、Freya Boggasch和Beatrice Schumann的出色技术支持。我们感谢Stryker Biotech, Hopkinton, MA (DC Rueger)的重组BMP-7。该研究得到了德国研究部的支持(资助号为01GG9824)。

作者指出

作者和联系

1. 安万特制药德国，功能基因组学，赛诺菲-安万特，法兰克福，德国

   马赛厄斯Gebauer

2. 赛诺菲-安万特，血栓性疾病/退行性关节疾病，法兰克福，德国

   Joachim Saas, Uwe Dietz & Eckart Bartnik

3. 德国Erlangen-Nürnberg大学病理学系骨关节与关节炎研究

   Jochen Haag和Thomas Aigner

4. 日本冈山大学医学与牙科研究生院生物化学与分子牙科学系

   Masaharu Takigawa

相应的作者

对应到托马斯·艾格纳．

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争利益。MG, JS, UD和EB都是赛诺菲-安万特聘请的研究科学家。该出版物是工业界和其他学术作者科学合作的结果。蛋白Tob1不是赛诺菲-安万特骨关节炎组合中的一个项目;因此，与行业相关的作者声明，他们和公司没有竞争利益。

作者的贡献

MG进行基因表达分析。JS培养了HCS-2/8细胞，并对获得的数据集进行了生物信息学分析。JH进行人体材料的收集和处理(包括RNA分离)。UD执行的原位杂交分析。MT贡献了HCS-2/8细胞系。EB参与了研究的设计，协调了包括生物信息学分析在内的基因表达实验。TA撰写了大部分的稿件，并参与了研究的设计。他的团队贡献了TaqMan、常规PCR和免疫组化分析(与JH一起)。所有作者都对稿件的撰写和修改做出了贡献，并批准了最终版本。

马赛厄斯·盖鲍尔、乔阿希姆·萨斯对这项工作也做出了同样的贡献。

再版和权限